共振光散射法测定核酸的含量.docVIP

第一部分 文献综述 1.1 共振光散射技术的原理 1.1.1 光的散射 光散射现象广泛存在于光与粒子的作用过程中，是指当光通过介质时在人射光方向以外的各个方向上所观察到的光现象。它源于光电磁波的电场振动而导致的分子中电子产生的受迫振动所形成的偶极振子。根据电磁理论，振动着的偶极振子是一个二次波源。它向各个方向发射的电磁波就是散射波[1]。光散射与介质的不均匀性有关。除了真空之外的其它所有介质都有一定程度的不均匀性。从而产生散射光。只是由于介质中粒子大小不同。产生不同种类的散射。 当介质中粒子直径远大于人射光波长时，产生的散射可看成是反射和折射。如果介质中粒子直径与人射光波长相近，便产生了Tyndall散射；如果介质中粒子很小，如时，便产生以Rayleigh散射为主的分子散射[2]。分子散射是由于分子热运动造成的局部密度涨落引起的。分子散射比Tyndall散射要弱得多。但是，即便十分纯净的液体和气体都能产生分子散射。根据人射光和散射光波长的不同，光散射又可以分为弹性光散射、非弹性光散射和准弹性光散射。其中弹性光散射又称为经典散射或静态散射。Rayleigh散射是的弹性散射，浑浊介质的Tyndall散射和透明介质的分子散射都是弹性散射。发射光波长与人射光波长不同的Raman散射是光与分子振动交换能量的非弹性散射。而Brillouin散射是由于热声波引起的非弹性散射。对多原子分子或基团，荧光是高能电子激发态跃迁到电子基态中的各振动转动态产生的电子振动跃迁而形成的宽带发射谱。所以在共振光散射测定中，荧光将产生干扰。对于人射光频率和发射光频率仅有微小差别的准弹性散射，是由于散射质点不停的作Brown运动所引起的多普勒效应使散射光频率以人射光频率为中心而展宽。即动态光散射[2]。 1.1.2 共振光的散射 当Rayleigh散射的波长位于或接近于分子的吸收带时，其散射程度将不再遵守Rayleigh散射定律。而且某些波长的散射程度急剧增强，这种现象称为共振Rayleigh散射(Resonance Rayleigh Scattering，RRS [3]。由于RRS具有Rayleigh散射和电子吸收光谱的双重特性，灵敏度与选择性都有所提高，在很大程度上弥补了Rayleigh散射信号水平低的缺陷，可以用于稀溶液中的分子研究[4]。由于共振光散射理论主要是从共振Rayleigh散射增强的角度出发的，有时也称共振光散射为共振Rayleigh散射。 1.2 共振光散射技术的实验方法及分析定量依据 在普通的荧光分光光度计上选择合适的激发和发射通带宽度，采用相等的激发和发射波长同时扫描激发和发射单色器所得的同步光谱（即），即为散射粒子的共振光散射光谱[2, 5, 6, 7]。 由于共振光散射光谱属于同步光谱，而散射光是源于等波长人射光激发散射粒子时产生的，因此散射粒子实际上是能发射出与激发光波长相等的新发光体，故而共振光散射信号属于同步发光[5-7]。根据同步发光方程 式中是在给定激发光波长处的激发函数，是在对应 的发射光波长处的发射函数,K是与仪器条件常数有关的常数，b是液池厚度。当时，即得共振光散射强度[5-7]： 即在仪器条件一定时，共振光散射强度与散射粒子的浓度成正比，据此可以用于散射粒子的定量测定[5-7]。 1.3 共振光散射技术在核酸分析中的应用 散射光在常规光分析中通常是作为一种干扰而被消除。1993 年, Pasternack 等用普通荧光光度计建立了共振光散射技术[8], 并将其用于生物大分子的识别、 组装和聚集研究。1995年，刘绍璞等人发现离子缔合物水溶液有二级散射(SOS)和反二级散射(ASOS)现象[9,10]，以此建立的分析方法，使共振光散射技术的应用范围进一步扩大。近年来，共振光散射技术已被广泛用于生物大分子的测定。目前，用于核酸分析的共振光散射探针主要有有机染料试剂、表面活性剂、大分子散射试剂、金属离子及络合物等试剂。 1.3.1 有机染料试剂 在共振光散射分析测定核酸的技术中，常用一些染料分子作为RLS探针。它是基于染料在核酸等生物大分子上进行堆积，即生物大分子对染料起了富集作用，使其上染料浓度远大于溶液中游离的染料浓度，相当于聚集体的生成，使散射球体体积增大，所以尽管吸收谱图无变化，但却观测到强烈增强的RLS信号[11]。 黄承志利用meso-4(对N-三甲基氨基)卟啉(TAPP)在pH=7.48条件下与核酸作用能产生增强的共振光散射信号，并在432 nm附近产生特征吸收峰，结果说明利用核酸对TAPP的共振光散射增强现象可以测得纳克级的核酸，测定检出限比荧光猝灭法低一个数量级[12]。 醌亚胺类的染料如藏红T(ST) [13]、中性红(NR) [14-17]、亚甲基蓝(MB) [18,19]可以在核酸分子表面