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乳品中有害微生物的控制检测技术及其发展方向1 摘要：从食品质量与安全的角度出发，系统地介绍了乳品中主要高危害致病菌及其危害、控制检测技术方法的历史进程、当前国内外乳品中有害微生物的控制检测方法、控制检测技术以及其发展方向。关键词：乳品，有害微生物、控制检测技术，发展方向2 引言：近年来，乳品安全事件频繁发生。其中大部分是由于污染致病菌引起的大规模乳品中毒事件，后经调查该批牛奶中含有大量金黄色葡萄球菌，这一事件再次使乳品安全问题成为社会各界关注的焦点。乳以安为重。有害菌的快速检验和有效鉴定对乳品的质量和安全有着重要意义。目前，常规的乳品检测手段有微生物法、理化法和免疫法等。随着分子生物学技术的发展，PCR技术、基因芯片、流式细胞技术等技术也被用于乳品中微生物的检测鉴定。本文综述了乳品中有害致病菌的控制检测技术及其发展动态和趋势。3乳品中主要有害微生物物种及其危害乳品中常见病原菌检测品种有：沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、小肠结肠炎耶尔森式菌、单增李斯特氏菌、大肠杆菌等,包括阪崎杆菌。这些致病菌可引起人类剧烈呕吐、腹泻、虚脱、急性胃肠炎等，甚至危及生命。4有害微生物检测方法的历史进程通常检测食物病原体有多种方法。17世纪中叶，荷兰人吕文虎克用自制的简单显微镜观察并发现了许多微生物；18世纪，体液酶的分析通过碱性磷酸酶检测肝功能、血清淀粉酶检测胰腺炎、酶类标志物检测心脏病；19世纪，放射及酶联免疫分析激素检测内分泌功能；肿瘤标志物检测癌症、蛋白标志物检测心脏病；20世纪，生化检测方法检测糖尿病、心血管病等；21世纪，应用分子生物学，通过实时定量PCR分子诊断仪实现基因诊断食品安全、病原体及传染、肿瘤、遗传病等。5乳品中有害微生物控制检测方法不论是用于生产、零售还是未指明用途的乳和乳制品，绝大多数国家对沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、弯曲杆菌、产气夹膜梭菌以及大肠杆菌均要求不得检出，而大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌的检测则有不同的限量标准。5．1 微生物学检测方法传统的微生物学检测方法有标准平板计数法(SPC)和显微镜直接观察法(DMC)。传统的微生物学检测方法具有所需设备简单，成本相对较低的优点。但其操作繁琐，检测周期长，且灵敏度较低，并且对于有些细菌无法给出正确鉴定。皿膜系统与即用胶系统法、疏水网格滤膜法、螺旋板系统均是学者们对这两种方法在提高操作效率和细胞计数方面的改进。疏水网格滤膜法优点是浓缩靶细菌，去除样品中的抑制因子．转移过程不需要再悬浮以免使菌体遭受物理破坏。滤膜法被广泛应用于生乳、巴士杀菌乳的质量管理中。5．2生物电化学方法生物电化学方法是指通过电极测定生物量产生或消耗的电荷提供分析信号的方法。微生物在滋生代谢过程中，培养基的电化学性质如电流、电位等会发生相应变化，所以可通过分析这些电化学参量的变化，实现对微生物的快速测定。在牛奶的检测中常见的有还原试验法、电导、阻抗法、生物传感器法。还原试验法避免了色素的生色灵敏度低、不能迅速测量的缺点。5．3免疫学检测方法免疫检测的基本原理是抗原抗体反应。不同的微生物有其特异的抗原，并能激发机体产生相应的特异性抗体。在免疫检测中，可利用单克隆抗体检测微生物的特异抗原，也可利用微生物抗原检测体内产生的特异抗体，两种方法均能判断机体的感染状况。运用于乳中致病菌的免疫学方法主要有免疫磁性分离技术、酶联免疫吸附技术(ELISA)等。各种免疫学方法的基本过程是相同的。先要进行病原菌的富集培养，再对富集物进行免疫检测和分析。前者需18～24h，甚至更长时间，而免疫检测过程则仅需几小时，甚至几分钟。免疫学方法也有许多需要改进的方面，主要包括交叉反应、假阳性多、灵敏度偏低。5．4分子生物学方法5．4．1 PCR技术PCR是一种在体外快速扩增特异目标基因的技术。它可以在试管中建立反应，获得足够数量的DNA拷贝。PCR历史发展为3个阶段：定性PCR(电泳法)、酶免法定量PCR、实时荧光定量PCR。实时荧光定量PCR技术相比定性PCR，它有如下突出优点：荧光定量PCR反应过程实时监测、荧光定量重复性好、基因定量分析稳定性好、荧光检测浓度梯度试验线性范围宽、荧光定量在对数期进行定量分析等优势。2005年5月20日，《奶粉中阪崎肠杆菌检测方法》标准的出台，解决了我国检测婴幼儿配方奶粉中阪崎肠杆菌无标准、无检测方法的问题。另外，多部国家标准明确要求用PCR方法检测阪崎肠杆菌、食品中致病菌等。在学术研究方面，胡建华等采用快速常规PCR和定量实时PCR相结合。对培养液中及牛奶阳性样品中的志贺氏菌进行检测，检出时间小于20 h。吕艳等人利用PCR技术可在5 h内检测牛奶中的金黄色葡萄球菌．最低检出限度35 ng／uL。赵宁等人采用过滤富集菌体后PCR技术来检测原料乳中蜡样芽胞杆菌。马冬等人利用PCR技术检测的是