细胞培养的操作流程.docVIP

实验题目：细胞传代 实验材料：细胞培养箱，安全柜，手套，酒精灯，吸管，移液管（5ml，10ml），50mL离心管，培养瓶（25cm2），移液枪，离心机，计时器，真空泵，抽滤瓶，水浴锅实验原理： 细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。 传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。 实验步骤：以Hela细胞为例说明具体实验操作步骤 实验前准备工作： 进细胞室先换拖鞋，带上手套75%的酒精进行表面消毒； 检查酒精灯有无95%酒精，电枪有无电； 将实验过程中用到的实验器材（包括培养瓶、50mL离心管、移液管）放于安全柜里，实验前开紫外15~20min； 将细胞培养液放于37℃水浴中预热； 抽滤瓶与真空泵相连，废弃缸套袋。 二．.准备实验： 先关闭紫外等30min后再进行实验； 75%酒精喷于纸上，将超净工作台仔细擦试干净； 点燃酒精灯，小心的将细胞从孵箱中拿出。 1．吸除旧的DMEM培养液： 拿出吸管（要拿吸管的上端），插入与抽滤瓶相连的橡胶管中，在酒精灯外焰灼烧灭菌，细胞培养瓶倾斜将吸管插入瓶底部一角，吸出旧的DMEM培养液，将用后的吸管弃于废弃缸里。2．消化： 拿出5mL移液管，插入电枪中，酒精灯过火灼烧，吸取2mL 0.25%胰酶，混匀，放于37℃孵箱中消化5-6min。 取下用后的移液管。 3．中和： 从孵箱中拿出培养瓶，显微镜下观察细胞是否被完全消化下来，5mL灭菌后移液管加入3mL DMEM培养液终止消化。 反复吹打混匀；吸出中和液转移到50mL离心管中。 4．离心收集细胞： 配平后离心200×g，3min。将新的DMEM培养液加入新培养瓶中，2mL／瓶（培养瓶底面积为25cm2）。 5．重悬细胞： 离心后吸出中和液，（先吸出表面泡沫，一定注意不要吸出细胞）。加入新DMEM培养液（按2mL／瓶和细胞传代数计算加入的培养液体积），用电枪反复吹打使细胞充分混匀，要尽量减少产生气泡。 6.分装： 混匀后将细胞分装，按2mL/瓶得体积加入培养瓶中，充分混匀。记号笔标记细胞名称，培养液，细胞传代数，传代日期，实验人员。 7．培养： 将细胞放于37℃,4% CO2细胞培养箱培养。将0.25%胰酶，细胞培养液密封好放于4℃冰箱中保存。 8．清洁安全柜 实验完毕后，盖灭酒精灯，关闭真空泵，用酒精棉球擦干净操作台表面。 9．观察： 每天观察细胞，并记录细胞生长状态。 实验注意事项： 1．紫外消毒过程中会产生臭氧分子，对人体有害。一般情况下，消毒后至少半小时后再进入。 2．所有的实验器材都要经过消毒处理；所有的细胞操作都在安全柜中进行，每一步都要注意不能用手碰到瓶口，培养液不能碰到瓶口，拿培养瓶时要使培养瓶瓶口微微翘起。 3．细胞消化时间不能太长，要让细胞尽快脱离不舒服的环境；离心时离心机转速不能太高，实验前要设定好离心转速和时间；重悬细胞时要保证细胞完全混匀，在显微镜下观察细胞是一个一个的。 4．传代培养时要注意无菌操作并防止细胞之间的交叉污染。所有操作要尽量靠近酒精灯火焰。每次最好只进行一种细胞的操作。每一种细胞使用一套器材。培养用液应严格分开。 5．每天观察细胞形态，掌握好细胞是否健康的标准：健康细胞的形态饱满，折光性好，生长致密时即可传代。 实验题目：细胞复苏 实验原理：细胞复苏的原则－快速融化： 必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。 实验材料：水浴锅，安全柜，冻存细胞，细胞冻存管，培养瓶，枪，移液管，细胞培养液，细胞培养箱 实验操作: 一. 实验前准备： 1.将水浴锅预热至37℃ 2.用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。 3.在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶。 二．取出冻存管： 1.根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。 2.从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞三．迅速解冻： 1.迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。同时配培养液：向50mL离心管内加入mlDMEM细胞培养液+1mL血清+100uL抗生素。 2.约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。向离心管中加入4mL培养液四.平衡离心 配平后，放入离心机中200×g， 离心3min 五.制备细胞悬液： 1. 吸弃上清液。 2．将剩余的6mL细胞培养液加入到离心后的细胞中，使细胞重悬，充分混匀。 六.细胞计数：细胞浓度以5×105/ml为宜。 七.培养细胞 将符合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内，培养瓶标明细胞名称，培养液，实验人