仙人掌多糖的分离纯化及性质研究03.docVIP

1 仙人掌多糖组成分析 采用苯酚一硫酸法，以半乳糖、阿拉伯糖按质量比3：1作标准曲线，测定总糖；DNS法测定还原糖；考马斯亮蓝法测定蛋白质；定磷法测定核酸。结果含多糖、还原糖，蛋白质、核酸的量分别为48．98％、3．38％、9．86％和7．35％。用碘化铋钾试剂、硅钨酸试剂、苦味酸试剂、碘一碘化钾试剂鉴定生物碱，用醋酐一浓硫酸试剂、三氯化锑试剂、lo％三氯醋酸试剂鉴定甾体类化合物。结果棕色环试验、蒽酮一硫酸法检测呈阳性，淀粉试、验呈阴性，双缩脲试验稍微变红，茚三酮试验颜色稍微变化[1]。 2 仙人掌多糖的提取 2.1仙人掌多糖的提取工艺 新鲜仙人掌茎→预处理（去刺、洗净、切片）→粉碎机粉碎→95%乙醇脱脂除色素→离心分离→取沉淀物→浸提→收集提取液→Sevag法脱蛋白→75%乙醇沉淀→取沉淀物→离心分离→倒去上层液体→烘干→透析法除小分子物质→真空干燥→得粗多糖 2.11 水提法 水提法为仙人掌多糖的传统提取方法[2]。研究了仙人掌多糖水提法的最佳工艺条件，以多糖提取得率为指标得最佳工艺：提取温度为80℃，提取时间为1h，固液比为1:40。[2]应用响应面分析法优化仙人掌多糖的浸提工艺，结果表明：水料比5.5:1，浸提温度75℃，浸提时间2.2h，浸提1次，仙人掌多糖的提取率为0.81％。 2.12 醇提法 [3]比较了用不同体积分数的乙醇溶液提取米邦塔仙人掌茎多糖的效率，结果表明以60%的乙醇为最佳。提取优化工艺为：以体积分数60％的乙醇为浸提剂，按每克仙人掌加15ml提取液投料，在70℃下浸提5h。 2.13 超声波提取法 据回归模型及其期望函数途径进行模拟选优，得到仙人掌多糖提取率的优化条件为超声破碎时间38min左右，料液比1:36（g/ml），pH值7.16左右。其中，影响仙人掌多糖活性的主要因子是pH值，在酸性或碱性环境下提取到的仙人掌粗多糖活性较低[3]。采用超声波提取仙人掌多糖，结果表明，超声波频率60kHz，作用时间15min，固液比1:25，醇沉倍数2.5倍，仙人掌粗多糖取率为28.6％，比水提法得率高[4]。 2.14 酸提法 研究表明，影响米邦塔仙人掌多糖提取的主要因素是浸提剂，其次是浸提温度，而浸提时间和液固比对提取效率的影响较小。其中，稀酸浸提的提取效果最好。最佳的提取方案是0.15mol/L H2SO4做提取剂，以1:15的固液比在70℃下浸提时间4h。 2.15 微波辅助提取法 采用微波辅助法提取米邦塔仙人掌多糖，通过设计正交试验，得出优化的工艺条件：以水为提取剂，料液比1:10（w ），提取2次，每次提取3min，微波炉功率700W，选用70％乙醇沉淀[5]。微波提取粗多糖的得率和含量分别为6.8％和8.5％，高于热回流提取粗多糖的得率4.7％含量8.3％。 3 仙人掌多糖的分离纯化 3.1 蛋白质、色素、低聚糖等杂质杂质的去除 用高浓度的低级醇处理提取液，可将仙人掌多糖沉淀出来。沉淀的多糖提取物中，常会含有一些低分子有机物、色素、大分子蛋白质等杂质，需分别除去。 常用的去除蛋白质的方法有：Sevag法，三氟三氯乙烷法，三氯乙酸法，酶法，或酶法与Sevag法结合，等电点沉淀法等[6]。选用了Sevag法、三氯乙酸法和酶法对仙人掌多糖提取物进行脱蛋白处理，结果表明，Sevag法的溶剂消耗量较大，处理时间比较长，样品损失严重。而酶法操作条件温和、利于保持多糖的活性、避免了使用有机试剂[7]。 常用的脱色方法有：离子交换法、氧化法、技术络合法、吸附法（纤维素、硅藻土、活性炭等）等[8-9]。一般情况下，可以用活性炭处理脱色，但活性炭会吸附多糖，造成多糖损失。DEAE-纤维素是目前最常用的脱色方法，通过离子交换柱不仅达到脱色目的，而且可以进行多糖的分离。 通过流水透析法除去低聚糖和其他一些小分子物质，这样得到是含有多种多糖成分的多糖的混合物[10]。 3.2 单一多糖的纯化 多糖纯化常用的分离方法有分级沉淀法、季铵盐沉淀法、离子交换层析法、凝胶柱层析法、盐析法等[11]。对仙人掌多糖的组分进行了初步分析，纸层析结果表明其总多糖由葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖等单糖组成。经DEAE-Dextran Gel A-25柱层析，可得一个中性组分和两个酸性组分[12]。经热水提取、乙醇沉淀、DEAE Sepharose fast flow离子交换色谱和Sephadex G系列凝胶滤过色谱纯化得到5种仙人掌多糖组分。5种多糖都已达到电泳纯，且是均一的。 4 多糖纯度鉴定 多糖的纯度标准不能用通常小分子化合物的纯度标准来衡量，即使是一种多糖纯品，其微观也是不均一的，通常所谓的多糖纯品实际上也只是一定相对分子质量范围的多糖的均一组分瞳¨．多糖的组分是否单一可以通过化学法、物