研究生蛋白质组学解答题集锦.docVIP

一、解释（共15分） 1、MALDI TOF MS（10分） 基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱（Matrix Assisted Laser Desorption Ionization / Time of Flight Mass Spectra），离子源是基质辅助激光解吸电离，质量分析器是飞行时间管。MALDI-TOF MS是近年来获得快速发展的一种软电离生物质谱，它的建立突破了生物大分子质谱分析的难题，该技术无论在理论上还是在设计上都具有简单、高效、灵敏、快速、准确、测定质量范围大等特点。 基本原理： MALDI是利用一定波长的激光脉冲，在极短的时间间隔内，对含被测样品靶物的一个微小区域提供高能量，从固相直接获得离子的电离方法，其基本特点就是使用了固体基质，特别适用于对热敏感或不挥发化合物的离子化，因此在蛋白质组分析中得到了广泛应用。 TOF分析器的离子分离是用非磁方式达到的，离子在离子源中形成后为电场所加速，进入真空无场漂移区，具有不同质荷比的离子因其通过漂移区的时间不同而实现分离，先后到达检测器产生信号。质量较轻的离子飞行速度快,较早到达检测器；较重的离子飞行速度慢，较晚到达检测器，且离子的飞行时间与其质荷比的平方根( m / z )1/2 成正比，因此可以通过检测飞行时间来测定离子的质荷比。 2、免疫共沉淀（5分） Co-Immunoprecipitation（Co-IP），是以抗体-抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法，是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。基本原理：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留下来。如果用蛋白质x的抗体免疫沉淀x，那么与x在体内结合的蛋白质y也能被沉淀下来。该技术可用于鉴定两种目标蛋白质是否在体内结合以及进行结合位点分析，还可用来筛选一种特定蛋白质的新的作用搭档。 二、 问答题（共85分） 1、Western Blotting 的流程（10分）。集蛋白样品(Protein sample preparation) 2. 电泳(Electrophoresis) (1) SDS凝胶配制 (2) 样品处理(3) 上样与电泳3. 转膜(Transfer) 4. 封闭(Blocking) 5. 一抗孵育(Primary antibody incubation)6. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation)7. 蛋白检测(Detection of proteins)8. 膜的重复利用(Membrane recovery) 2、血浆/血清蛋白质组研究中需要着重注意的问题（10分）。 因血浆血清中的含有各种蛋白质及降解产物，想要获得所需蛋白，需选择适合的前处理条件，尤其在进行血浆的肽组学分析时显得更为重要。 1、血浆/血清样品选择 ①去血小板的血浆由于避免血小板的激活作用，减少了蛋白质的体外降解，因而较血清更适合一定的肽组学研究； ②去血小板的EDTA血浆或枸橼酸血浆样品，更适合分析低分子质量的蛋白质； ③如果要使用一定的蛋白酶抑制剂，一定要在早期加入，而且要谨慎使用，因为抑制剂的加入可能对MS分析造成一定的干扰，而且一些小分子的抑制剂与蛋白质结合转化成蛋白质的亚型，这些都将使得分析结果变得复杂。 2、样品的收集与贮存 ①为减少血小板的污染，血液样品在分析前最好用0.2μm的低蛋白质结合膜过滤，样品分装冰冻储存，减少融化-再冰冻的循环； ②样品应分装并贮存在液氮中，减少或不加蛋白酶抑制剂，以减少对测定结果的干扰。 3、去除高丰度蛋白和分级技术 血浆/血清样品中蛋白质种类很多，而且所含蛋白质具有较大的动力学范围，其中有许多丰度较高但不含有特殊生物学信息的蛋白质，这将会对目标蛋白质的分析造成极大的困难，甚至根本不能检测低丰度蛋白质，因此，通过对原始蛋白质进行洗脱和分步分离减少样品中蛋白质的复杂性，可以极大简化蛋白质的预测和分析，提高对低丰度蛋白质的检测和识别的灵敏度和准确度。 4、多维策略的运用 3、药物蛋白质组学定义及主要研究领域。试举例说明其在药物靶点的发现和确认中的应用（10分）。 药物蛋白质组学就是蛋白质组学技术在药物研发中的应用。 药物蛋白质组学的主要研究领域：1临床前研究-发现所有可能的药物作用靶点，以及针对这些靶点的全部可能的化合物，以及应用蛋白质组学方法研究药物作用机制和毒理学；2临床研究方面-发现药物作用的特异蛋白作为患者选择有效药物的依据和临床诊断的标志物，或以蛋白质谱的差异将患者分类并给予个体化治疗。 药物蛋白质组学在药物靶点发现和确认中的应用举例： （1）研究人员通过比较给药前后的蛋白质组，找到了药物阿霉素抗乳腺癌的一个作用靶标Hsp27。