植物生理学中各项生理指标的测定方法.docVIP

一.实验内容 实验1 MDA(丙二醛)含量测定所需试剂： 10%三氯乙酸（TCA）（纯） 0.25%硫代巴妥酸 (纯) 实验2：可溶性蛋白含量测定所需试剂： 考马斯亮蓝G-250 95%乙醇 85%磷酸 实验3：SOD(超氧化物歧化酶)酶活性测定所需试剂： dl-甲硫氨酸（Met） NBT EDTA-Na2 核黄素 实验4：CAT(过氧化氢酶)活性（过氧化氢酶）测定所需试剂： PBS（PH=7.0） 30% H2O2 实验五：Apx(抗坏血酸过氧化物酶)活性（即ASA—POD活性）测定所需试剂： ASA（分子量167.12） (乙=胺四乙酸=钠)EDTA—Na2 PBS (pH7.0) 30%H2O 实验6： ASA(维生素C)含量测定 偏磷酸 95%乙醇 磷酸 4% 2,2-二联吡啶 FeCl3（或FeCl3·6H2O） 实验7：GSH(谷胱甘肽, 媚力肽GSH GSH是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸结合而成的三肽化合物)含量测定所需试剂： NaH2PO4·2H2O DTNB（二硫代硝基苯甲酸） PBS (PH6.8) 实验8：脯氨酸测定所需试剂： 磺基水杨酸 甲苯 茚三酮 冰乙酸 85%磷酸 试验9：叶绿素含量测定。 80%丙酮 试验9：GR活性测定 试验10：过氧化氢含量测定。 三氯乙酸 试验11：超氧阴离子含量测定 二．酶液和母液提取 1. 酶液提取所需试剂：50mmol/L磷酸缓冲液（PH=7.8）(内含1% (m/v) 聚乙烯吡哆烷酮PVP），0.1mmol/LEDTANa2或EDTA)，也可为（内含2% (m/v)PVP），0.2mmol/L EDTA Na2或EDTA）（先配制后用缓冲液定容） 2. ASA . GSH母液提取所需试剂：5%偏磷酸 1．抗氧化酶酶液提取（SOD.POD.CAT）： 1g（根据样品的量,少的可以适当减少）叶片加入预冷5ml. 50mmol/L磷酸缓冲液（PH=7.8） ↓ 4℃冷冻15000g离心20分钟 ↓ 上清液即为酶液（5℃下保存一两天内备用，中短期用-20℃保存） 2．ASA . GSH母液提取： 0.1g叶片加入3ml预冷5%偏磷酸溶液 ↓ 4℃冷冻14000g离心10分钟 ↓ 上清液即为母液（5℃下保存备用） （偏磷酸可显著沉淀蛋白质和保护ASA） 酶液提取所需试剂： PVP（聚乙烯吡哆烷酮）：1%（1g溶于100ml水），1000ml需称取10g，此处用PBS EDTA-Na 2 : 0.1mmol/L (37.2mg EDTA-Na2溶于1000ml蒸馏水)，此处用PBS PBS（缓冲液）配制方法：① Na2HPO4·12H2O ② NaH2PO4·2H2O 取① 71.64g，蒸馏水定容至1L，取② 31.21g定容至1L，放置4℃冰箱备用 PH=7.8 取① 91.5ml+② 8.5ml=100ml (浓度0.2mol/L) 需要0.05mol/L→将上述溶液烯释至400ml （0.2mol/L*0.1=0.05mol/L*V） 母液提取所需试剂： 5%偏磷酸：称5g纯偏磷酸，定容至100 ml蒸馏水（需加热溶解，温度在50-60℃）偏磷酸有剧毒 （偏磷酸难溶解，先得用研钵提前研碎，后用磁力搅拌器溶解一到两天后再定容） （现所用为38%HPO3，所以需称65.7895g，定容至500ml） 三．实验步骤 实验1：MDA含量测定 1.1所需试剂：10%三氯乙酸（TCA）（纯） 称10g定容至100ml 0.25%硫代巴妥酸 (纯) 称0.25g用10%TCA定容至100ml （配制时，可一次完成，先配TCA，不要定容，再加入硫代巴比妥酸，然后定容，若难溶解，可以在磁力搅拌器上微热） 1.2步骤：取0.3g叶片，加4ml磷酸缓冲液研磨， 加入 4ml 0.25%的硫代巴比妥酸（溶于10%的三氯乙酸）溶液 ↓摇匀 95℃加热15分钟 ↓快速冷却 3000g离心15分钟 ↓ 取上清测定 OD532，OD600，OD450值 ↓ 按公式求 MDA浓度=6.45×（OD532-OD600）-0.56OD450 (μmol/L) 可溶性糖浓度=11.71×OD450 (mmol/L) 最后计算 MDA含量（μmol/g FW）= [4×（MDA浓度x）×10-3/0.1] 同时，可测得可溶性糖含