肿瘤细胞培养上清液对大鼠骨髓来源内皮祖细胞功能和活性影响及PI3K%2fAkt在内皮祖细胞分化中作用的研究.pdf

·中文论著摘要· 肿瘤细胞培养上清液对大鼠骨髓来源内皮祖细胞功能 I 和活性的影响及P3K／Akt在内皮祖细胞分化中 作用的研究 刖 舌 内皮祖细胞(endothelialcells，EPCs)是一类参与循环增殖并能分 progenitor 化为血管内皮细胞(endothelialcells，ECs)，但还未能表达成熟血管内皮细胞表型， 也未形成微血管的前体细胞。出生后EPCs主要存在于骨髓，在某些情况下可以被 动员到外周血，归巢到靶组织参与生理或(和)病理性血管生成。血管的形成主要 stem 是指在原来没有血管系统的情况下，通过EPCs和造血干细胞(hematopoietic cell，HSC)产生血流的新通道。近来的证据表明，恶性肿瘤中不仅存在血管新生， 还可能存在由EPCs介导并重新形成血管的血管生成。血管生成在肿瘤生长中是不 可缺少的重要环节，越来越多的研究显示EPCs在肿瘤血管生成中起重要作用。 EPCs的分化要通过复杂的信号通路调节细胞内部多种基因的表达，最终引起 EPCs向成熟ECs分化。目前对EPCs分化的研究主要从形态和细胞表面标志两方 面入手。在形态上无法将EPCs与其他细胞区分开来，所以主要靠分子标志识别。 ACl33是新近发现的干细胞标记，不表达于成熟ECs，认为是目前区分血管EPCs 与ECs的最主要标记。vWF(von 小体中，血浆中V、7iVF绝大部分系由ECs分泌，它是血管内皮的分子标志物。研究 失去ACl33，并开始表达成熟ECs特有的表面标志，如vWF。 P13K／地信号通路是调节各种细胞生长、代谢、分化的重要信号通路。磷脂 受体超家族信号转导过程中的重要成员，可受多种细胞因子和理化因素激活。丝／ B，Akt)是位于P13K下游的一个重要激 苏氨酸蛋白激酶B(Ser／Thrprotein虹I瑚e 酶，二者均是促进细胞生存和维持细胞正常功能关键的信息分子，并且共同构成 细胞应激反应过程中促进细胞生长、抑制细胞凋亡和维持细胞重要功能的信号传 递链。 实验方法 1、EPCs的分离、培养、纯化与鉴定 采用Ficoll密度梯度离心法结合差速贴壁筛选法从大鼠骨髓分离EPCs；收集 化的EPCs。 2、EPCs增殖的检测 x 消化收集贴壁EPCs；以5 103／孔的细胞数接种于96孔板中，每孔体积2009l； 放入37。C、5％C02的孵育箱内培养卜2h；待细胞基本融合，加入无血清DMEM 作用12h；加入不同体积分数(O％、10％、20％、40％)肿瘤细胞培养上清液；检测 时，每孔加入20肛1 微量振荡器震荡10min，置酶标仪测OD 490值。 3、EPCs迁移的检测 以5X Transwell小室的下室；检测时，PBS冲洗3遍，用棉签擦拭膜上表面未迁移的细 胞；100％甲醇固定膜下表面，苏木素染色；将膜切下，用中性树胶封固于载玻片 上；在400倍光学显微镜下随机选取5个视野计数迁移的细胞数。 4、EPCs管腔形成的检测 以5X 积分数(0％、10％、20％、40％)肿瘤细胞培养上清液；在100倍倒置相差显微镜下 2 随机选取3处管腔密集的视野计数管腔数。 5、Western Blot检测EPCs分化相关蛋白表达 提取细胞蛋白质；测量待测样本氏翮值；蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳；免疫 印迹法；蛋白印迹的分析。 6、RT-PCR检测EPCs分化相关因子mRNA表达 从互联网eDNA文库检索原始序列，参照国外文献设计，分别由大连宝生物 工程有限公司和赛百盛公司合成引物；Trlzol法提取细胞总I斟A；反转录反应； PCR反应。