靶向不同肿瘤基因shRNA瞬时表达载体构建及联合抗肿瘤活性的研究.pdf

中国医学科学院博士论文 中文摘要 中文摘要 癌症的发生与多基因异常有关，包括癌基因的活化和抑癌基因的失活。RNA 干扰被认为是一种非常有潜力的肿瘤治疗手段，利用RNA干扰技术抑制癌基因 的表达可以逆转肿瘤的恶性表型。但仅就一个基因为靶点往往只能部分逆转肿瘤 的恶性表型，治疗效果有限。为寻求更加理想的抗肿瘤效果，可以在两方面进行 研究：第一是将RNA干扰技术联合化疗药物，第二是利用RNA干扰技术靶向 多个癌基因。我们就这两方面进行了研究。 第一部分靶向N．Ras的shRNA联合长春新碱的抗肿瘤活性研究 肝癌是常见的恶性肿瘤之一，虽然有手术、放化疗和肝移植等治疗手段，但 是肝癌的死亡率仍然很高，5年存活率小于11％，因此有必要寻找新的、更有效 的治疗方法。已有研究显示，RNA干扰下调肝癌形成相关基因的表达能有效抑 制肝癌细胞的生长。为了取得更好的效果，我们将靶向N．Ras的RNA干扰表达 。pCSHl．shNR联合VCR的体外抗肝癌活性 VCR的细胞存活率为77．24％， pCSHl．shNR处理的细胞存活率为55．O％，1．5nM VCR联合处理的细胞存活率为34．60％，两药相互作用系 pCSHl．shNR与1．5riM 与2．5nMVCR联合处理的细胞存活率为17．32％，CDI为0．64。结果说明转染 pCSHl．shNR联合长春新碱对HepG2细胞的生长有显著协同抑制作用。 R联合时，克隆形成率为6．67％，与单独处理比 为13．75％，pCSHl．shNR与VC 较克隆形成抑制率有明显提高。 二、不同处理对增殖相关蛋白水平变化的影响 2 中国医学科学院博上论文 中文摘要 MEUERKl／2和Ras／P13l淞kt通路的阻遏作用。 细胞核因子NF．r,B是一种重要的核转录因子，其过表达和活化与癌症的发 的下调可以诱导细胞对VCR的化疗敏感性。我们检测了不同处理对NF．r,B通路 被整体下调，并且被抑制的程度大于其它处理组。 表皮生长因子受体(EGFR)参与Ras信号通路的活性调节及细胞对VCR Blot检测 作用的响应，在HepG2中表达组成型的磷酸化EGFR。Western 与VCR联合处理协同下调了EGFR的表达，N．Ras的表达抑制减弱了细胞响应 VCR处理时对EGFR的活化。 三、pCSHl．shNR联合VCR对HepG2细胞周期分布的影响 可以引起G2／M期阻滞，结果说明VCR引起的细胞周期阻滞是剂量依赖性的。 期或G2／M期阻滞。 Western blot检测细胞周期蛋白(Cyclin)和依赖细胞周期蛋白的蛋白激酶 理都下调了cyclin 的下调作用显著提高。此外，pCSHl一shNR可以逆转VCR引起的cyclinE和cyclin 与VCR联合处理使Cyclins和Cdks的整体活性水平趋于下降。 Western 3 中国医学科学院博士论文 中文摘要 使Rb磷酸化水平略有下调，E2F．1表达略有下降；VCR使Rb磷酸化水平大幅 对照组，但也显著低于VCR组，联合组的E2F．1表达下降最多。结果说明 用。 四、pCSHl．shNR联合VCR对HepG2细胞凋亡的诱导作用 协同诱导HepG2细胞凋亡。 Western 强了VCR对HepG2细胞的凋亡诱导作用。 五、pCSHl．shNR联合VCR诱导细胞衰老的作用 18．76％。结果说明pCSHl．shNR联合VCR诱导细胞衰老的能力更强。 六、pCSHl．shN欺于VCR诱导MDRl基因表达的影响 有关，而gas癌基因可以调控MDRl基因的表达。WesternBlot检测结果显示， 于VCR处理组。 的抑制效