大蒜DNF提取实验报告.docVIP

SOD的制备与活性测定 一、试验目的 了解SOD的制备方法。 了解SOD的活性测定方法。 二、 SOD的应用 SOD是一种广泛存在于生物体内,能催化超氧负离子发生歧化反应的金属酶类。由于该酶能有效清除机体内超氧自由基,从而有效地预防活性氧对生物品的毒害作用,因而具有抗辐射、抗肿瘤及延缓机体衰老等功能,在保健品、医药和化妆品行业中有重要的应用价值。研究表明,外源SOD具有保护DNA、蛋白质和细胞膜的作用,使其免遭超氧负离子的破坏,对辐射有防护作用。 三、大蒜SOD的价值 大蒜所含化学成分十分复杂,含有挥发油、多种氨基酸、维生素、糖及丰富的蛋白质,并含有多种矿物质及微量元素。研究证明大蒜具有卓越的抗菌、抗病毒、抗肿瘤、降血脂、提高机体免疫功能、降血糖、解毒等功效。近年来将大蒜用于农、林、牧、渔方面防治病虫害和提高产量的研究也有很大进展。大蒜被美国《时代》专刊推荐为现代人十大最健康的食品之一。我国是世界大蒜种植的第一大国,产量和出口量均居世界前列。因此研究开发利用大蒜资源具有重要意义。 目前我国传统工业大多从动物的血液和内脏器官中提取SOD，但这类原料来源有限，成分复杂，且在储存、运输等方面存在诸多不便，因此容易导致生产工艺复杂化，使生产成本大幅度上升。近来的研究发现，大蒜细胞中含有丰富的Cu、Zn-SOD，其分子量约为32000，与从牛血等动物血红蛋白中所提取的SOD十分接近，,用大蒜提取可使生产成本显著降低,而且生产工艺也能得到很大简化,这对于扩大生产规模、实现SOD的广泛应用十分有利，而且其它各项性能也来源丰富、易于处理而使生产成本大大降低，而且生产工艺也能得到很大的简化，这对于扩大生产规模，实现SOD的广泛应用将是十分有益的。 四、实验原理 SOD是生命体中的一种重要的超氧负离子的清洁剂，具有抗氧化，抗辐射，和消炎作用。它可以催化超氧负离子进行歧化反应： WLMD-1 SOD是一种广泛存在于生物体内的金属酶，该酶可催化超氧阴离子自由基生成为过氧化氢和氧分子。 1)由于金属辅基的存在，SOD的耐热性较强，在65℃以下温度对酶活影响很小，但温度一旦高于70℃，酶活力则下降很快。提取植物SOD的最适宜温度为55 - 65℃，最适宜的热变性时间为15min。大部分蛋白质的变性温度为55℃，可以利用SOD和杂蛋白变性温度的差异进行热变性实现初步分离。先用氯仿-乙醇分离出杂质蛋白，然后用冷的丙酮沉淀SOD蛋白。 测定SOD活性时，依据邻苯三酚在弱碱性环境中会发生自氧化反应和SOD将O2-歧化分解成H2O2和O 2抑制邻苯三酚的自氧化速率的关系:, 间接推算SOD分解超氧阴离子自由基的能力。 2) 邻苯三酚在碱性条件下可迅速自氧化,释放出O2-,生成带色的中间产物,O2-和H2O2，从而阻止了中间产物的积累，降低了自氧化速率。产物在nm有最大吸收峰。邻苯三酚自氧化产生的中间产物在40s-3min这段时间，生成物与时间有较好的线性关系 SOD同工酶在紫外和可见区的特征吸收峰 SOD同工酶 Cu-SOD Mn-SOD Fe-SOD 吸收峰 紫外区（nm） 可见光（nm） 进行特征吸收峰测定可初步判定物质成分 WLMD-2 五、仪器: 台式离心机、超声波细胞破碎、恒温水浴锅、分光光度计、电子天平、圆底烧瓶、烧杯、玻璃棒、垂直电泳仪。 六、材料与试剂 大蒜、Na2HPO4、NaH2PO4、Tris、EDTA、NaOH、丙酮、乙醇、盐酸。 七、操作 7.1酶液的制备(热变性法制备) ①组织破碎 将新鲜的大蒜用大量清水洗净, 再用蒸馏水洗净,滤纸吸干后称取约35g 放入榨汁机内破碎匀浆,使组织或细胞破碎。 ②SOD提取 向上述破碎细胞中加入2~3倍体积的0.05mol/L ，PH7.8磷酸缓冲液继续研磨搅拌20min或冰水浴超声波破碎5min,充分溶解酶液，过滤取上清液, 测体积。 ③除杂蛋白 将上清液置于60 ℃ 水浴锅中20m in,使杂蛋白热变性,然后以10000r/min冷冻离心20 min , 弃杂蛋白沉淀，得粗酶液。 ④SOD的沉淀分离 用盐酸调节SOD 粗提液p H值5.0,加人0.6 倍体积预冷丙酮, 搅拌均匀后10O0r/m in冷冻离心20m in, 除去沉淀杂蛋白, 取上清液,再调pH值4.0,继续加人0.2倍体积预冷丙酮, 搅拌均匀后100OOr/min冷冻离心20m in ,收集沉淀。将沉淀溶于最小量的5mmol/L、p H7.8 磷酸缓冲液中。 7.2提取物分析 ①紫外-可见光谱测定