食品致病菌鉴定pcr操作sop.docxVIP

致病菌PCR检测标准操作程序1 目的：保证致病菌PCR检测结果准确、可靠。2 适应范围：致病菌PCR定性检测，样本类型为增菌液3 试剂、耗材来源：商品试剂盒，PCR专用耗材质控物：ddH2O做空白,阴性、阳性对照来源于试剂盒4 仪器：BIO-RAD T-100 PCR仪 0550102 ；BIO-RAD电泳装置 0540102 ；BIO-RAD凝胶分析成像系统； 0590102 ；生物安全柜 (BSC-1300IIA2) 0490102 ；高速离心机 (TDL-16G) 0470102 ；微量移液枪(0.5-10μL、10-20μL、20-200μL、1000μL)。5 标准操作:5.1样本的处理：根据国标GB 4789系列增菌步骤处理(例如：金葡按GB4789.10-2010)5.2试剂配制0.5×TBE:取10ml50×的TBE加灭菌超纯水稀释至1000ml，摇匀备用。DNA提取、PCR反应体系、上样缓冲液等试剂:均为商品试剂 。增菌培养基:配置参照微生物培养基配置记录。DNA提取（参考DNA提取试剂盒操作标准说明）5.3.1取1ml菌液（≤2×109个），10，000rpm离心30秒，倒掉上清，收集菌体。5.3.2加入200μL缓冲液RB重悬，10，000rpm离心30秒，弃上清。将菌体重悬于180μL缓冲液RB。5.3.3加入20μL（革兰氏阳性菌120μL）溶菌酶（20㎎/ml）颠倒混匀，37℃水浴30分钟，12,00rpm离心2分钟，弃上清，重悬于180μL缓冲液RB中。5.3.4加入20μL蛋白酶K（20㎎/ml）溶液，充分混匀，再加入200μL结合液CB，立即漩涡充分混匀，70℃水浴10分钟。5.3.5冷却后加入100μL异丙醇，立即漩涡混匀。5.3.6将上一步混合物转入吸附柱AC中，13,000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液。5.3.7加入500μL抑制物去除液IR，12,000rpm离心30秒，弃废液。5.3.8加入700μL漂洗液WB，12,000rpm离心30秒，弃废液。5.3.9将吸附柱AC放回空收集管，13,000rpm离心2分钟，尽量去除漂洗液，以免影响下游反应。5.3.10取出吸附柱，放入干净离心管中，在吸附膜的中间位置加入100μL洗脱液EB，室温放置3~5分钟，12,000rpm离心1min，将得到的溶液重新加回吸附柱，12,000rpm离心1min。5.3.11得到的DNA溶液4℃保存，若长期保存置于-20℃保存。5.4 PCR扩增 将得到的样品DNA 与致病菌PCR试剂盒中引物、Taq酶等按说明书操作，加于PCR反应管，加样在洁净区操作，上机；表1 普通PCR反应体系试剂贮备液浓度50μL反应体系中加样体积/μL10×PCR缓冲液------2.5dNTPs 2.5 mmol/L1.0上游引物20 pmol/μL1.0下游引物1.0Taq酶5 U/μL0.5DNA模板-------2.0双蒸水-------补至50注1：反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整。注2：每个反应体系应设置两个平行反应。表2 PCR 反应条件菌类扩增片段长度PCR反应条件预变性变性循环数后延伸沙门氏菌284bp95℃，5min95℃,30s64℃,30s 72℃,30s3572℃,5min志贺氏菌629 bp95℃，5min95℃,15s65℃,30s 72℃,30s3572℃,5min金黄色葡萄球菌132bp94℃，5min94℃,2min57℃,2min72℃,1min3572℃,7min单增李斯特氏菌274bp95℃，5min95℃,30s55℃,30s 74℃,1min3572℃,5min副溶血性弧菌450bp95℃，5min95℃,1min60℃,1min 72℃,2min3572℃,5min5.5电泳凝胶制备:称1.5-2g琼脂糖溶于100ml0.5×TBE溶液，煮沸，待冷至60℃左右，加入4μL的Gold View，摇匀，倾入制胶板，冷却待用。点样:将PCR产物5μL与6×Loading Buffer1μL混匀，小心加入点样孔。电压5V/㎝，设为80V~100V。时间20~40分钟。5.6荧光成像电泳完成后，佩戴PE手套将凝胶置于托盘，移于成像处，关闭舱门，脱掉PE手套，点击鼠标，运行试验协议。成像完毕，带上PE手套取出凝胶，置于生物危害待处理区。6 结果分析:空白对照、阴性对照无扩增，阳性对照正常检出实验判定有效，反之判定实验无效。若实验有效，产物扩出目标条带为阳性，未扩出为阴性，阳性结果用以下传统方法确证。食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门