大鼠下丘脑神经元培养的新方法.docVIP

大鼠下丘脑神经元培养的新方法 王旭辉，张岫竹，王伍超，刘大维，代 维，周继红 （第三军医大学大坪医院野战外科研究所第四研究室，全军交通医学研究所，创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室， 重庆 400042） 摘 要：目的 通过对大鼠神经元培养方法的改进研究，寻找更佳的下丘脑神经元培养方法。方法Neurobasal + B27+GlumaxⅠ的神经元培养NF-200对细胞进行免疫组织化学染色鉴定。观察比较下丘脑神经元的细胞密度、神经元轴突长度和胞体面积等指标变化。结果培养方法均获得良好的培养效果改进方法细胞密度均优于原培养方法神经元轴突长度和胞体面积方面下丘脑是下丘脑-垂体-肾上腺轴的核心，提取下丘脑神经元进行体外培养，建立下丘脑神经元体外实验平台具有重要意义。早期神经细胞培养中，使用DMEM+胎牛血清+Glutamine的培养体系。近来Neurobasal + B27 + GlumaxⅠ的神经元培养的使用，使培养神经元的纯度大为增加[1]，但尚见将最新的神经元培养技术应用于下丘脑神经元培养的相关报道。我们成功地将Neurobasal + B27+Glumax方法运用于大鼠下丘脑神经元的培养，并对培养方法进行了一些改进，使下丘脑神经元的存活率和生长速度都得到明显提高。 小鼠抗大鼠NF-200、Hepes、胰蛋白酶Ⅺ、蛋白酶抑制剂、DNASEⅠ、多聚赖氨酸、Triton-100均购自美国Sigma公司GluMaxⅠ、神经培养基、B-27购自美国Gibco公司庆大霉素购自美国Amesico公司BSA、兔抗小鼠IgG FITC、封闭用正常山羊血清、抗体稀释液购自北京中杉公司多聚甲醛购自上海生化试剂厂。 取健康Wistar新生鼠（23 d）。将新生鼠脑组织取出置于 0 ℃的 DM（含Hepes 10 m, 葡萄糖33.3 m, 庆大霉素5g/ml，BSA 0.3％，MgSO4 12 m，以DHanks液溶解，pH值 7.27.4）溶液中，切去视交叉前部，保留约2 mm 厚脑片，在解剖显微镜分离出第三脑室顶端2 mm、左右1 mm 范围内脑组织。将脑片组织置于37 ℃的消化液（含胰蛋白酶Ⅺ 2 mg/ml，DNAⅠ 0.2 mg/ml，NaHCO3 4.2 m，Hepes 25 m，NaCl 137 m，KCl 5 m，Na2HPO4 7 m，蒸馏水溶解，pH值7.27.4）2 min，然后于室温放置3 min。去除消化液将脑组织转至低浓度胰蛋白酶抑制剂中（含胰蛋白酶抑制剂0.6 mg/ml，以DM溶解）漂洗，随后转至高浓度胰蛋白酶抑制剂中（含胰蛋白酶抑制剂1.2 mg/ml）置于37 ℃环境中1 min，然后以0 ℃ DM漂洗脑组织4次。将漂洗过的脑组织转至0 ℃的DNAⅠ（0.2 mg/ml，DM溶解）溶液中，并用巴士德吸管吹打组织。将吹打均匀后的组织放置于冰台上静置5后上清吹打残余组织，静置5后上清600 r/min 4 ℃低温离心5 min。离心后上清液体，入神经培养基（含2％ B-27，GluaxⅠ 2 mmol/L），用巴士德吸管吹打成为均匀的悬液。使用160 μm细胞筛过滤，将滤液均匀接种至3个预先包被了多聚赖氨酸的35 mm培养皿中，加入庆大霉素（10g/ml）。放置于37 ℃，5% CO2细胞培养箱中，每2 d更换20％的培养液。600 r/min 4 ℃低温离心5 min离心后上清液体，入神经培养基（含2％B-27，GluaxⅠ 2 mmol/L），用巴士德吸管吹打成为均匀的悬液使用160 μmμm细胞筛过滤，将滤液均匀接种至3个预先包被了多聚赖氨酸的35 mm培养皿中尽快将神经元接种入培养基，避免损伤冲去杂质，每d换，更换全部培养基。1.3神经元鉴定 取培养4d神经细胞，于室温下使用4％多聚甲醛固定20 min。PBS冲洗次，每次5 min。0.3％ Triton-100溶液加入培养皿，室温30 min，然后以PBS冲洗3次，每次5 min。向清洗过后的细胞加入抗原修复液，室温30 min，然后再次用PBS清洗3次，每次5 min，然后加入山羊血清封闭液，室温20 min。去除多余液体，不再冲洗，直接加入1100稀释的一抗小鼠抗大鼠NF-200多克隆抗体，4过夜。次日将标本放置于37复温1，然后以PBS冲洗次。加入1100稀释的二抗小鼠IgG FITC荧光抗体，37避光30 min。置于荧光显微镜下进行观察。 he National Basic Research Program (973 Program) (2005CB522602) 作者简介：王旭辉，男，吉林省吉林市人，硕士研究生，主要从事应激神经生理方面的研究。电话：（023E-mail: wx126.com. 通信作