利用微生物全细胞方法通过α-羟基化2-苯乙酸衍生物与还原α-酮酯制备互为对应异构体(S)与(R)-扁桃酸.doc

利用微生物全细胞方法 通过α-羟基化2-苯乙酸衍生物和还原α-酮酯 制备互为对应异构体的（S）和（R）-扁桃酸衍生物 摘要：利用不同分类群的41种微生物通过对映选择法还原苯甲酰甲酸甲酯得到（R）-扁桃酸甲酯，对映体变量中等偏高。相反，长蠕孢菌中的单加氧酶CIOC3.3316催化羟基化的2-苯乙酸甲酯得到（S）-扁桃酸甲酯。这种氧化和还原生物转化的结合提供了一种制备手性α-羟酸衍生物对映体的方法。 一、简介 由于对不对称合成兴趣的逐渐增加，促进了在有机合成中生物转化方面取得了很大的进展，并且已经广泛的用于手性化合物的合成中。光学纯的α-羟酸及其衍生物是合成大量不同生物活性分子和其他精细化学药品的重要的基础。此外，扁桃酸和其衍生物已经发现是手性拆分过程中药物制剂和拆分剂的万能媒介物。由于对这些化合物产生了浓厚的兴趣，以开发了几种方法用来得到其光学纯形式。包括，动态拆分外消旋的α-羟酸酯，水解cyabohydrin以及还原前手性的α-酮酯。然而，扁桃酸甲酯和其衍生物很难从他们对应的前手性芳香族的羧基诱导剂通过C-H氧化得到。区域和立体选择的羟基化2-苯乙酸衍生物是制备有旋光性的扁桃酸衍生物最简单的途径。然而，在合成化学中区域和立体选择羟基化有活性的C-H仍然是一个挑战。除此之外，羟化反应可能是这类转化的一种有效途径。 Adma等人报道，α-氧化的长链羧酸通过豌豆中的氧化酶作用得到有旋光活性2-羟酸。目前，Arnold 等人首次利用设计的细胞色素P450BM-3对映选择氧化1形成（S）-2；然而，设计过的细胞色素P450BM-3与2-苯乙酸的的反应收率中等偏低并且对映体过量中等偏高（82-90%）。Holland小组报道与长蠕孢菌NRRL4671作用的长链链腈（C6-C10）后可得到低产量的（R）-2-链烯醇（8-19%）并且有很高的光学纯度（ee95%）。 在这当中，我们报道了一种微生物菌株（长蠕孢菌CIOC3.3316）使2-苯乙酸甲酯通过羟基化作用生成（S）-扁桃酸甲酯，并且有很高的对映选择性（92%ee）。此外，这篇文献中同样报道了对一些可以还原苯甲酰甲酸甲酯生成（R）-扁桃酸甲酯微生物进行的研究。这种氧化和还原生物转化的结合提供了一种制备手性α-羟酸衍生物对映体的方法。（图1） 二、结果与讨论 2.1氧化 从表1显示的结果来看，长蠕孢菌CIOC3.3316对（S）-构型有很强的立体选择性。菌株（1，3-5）呈现出很低的活性或者没有活性。然而，长蠕孢菌CIOC3.3316的对扁桃酸甲酯的产率却达到62%并且对映体过量为92%（菌株2）。 目前，Arnold等人首次利用设计的细胞色素P450BM-3（BM-3从大地懒属杆菌中分离得到）对映选择氧化1形成（S）-2（90%对映体过量），其能够对映选择在某一羧基和肽基团的α-位发生羟基化作用。相比Arnold等人的研究，我们采用野生菌株（长蠕孢菌CIOC3.3316）作为生物催化剂，同时（S）-2由休眠的全细胞制备，对映体过量为92%。另外，全细胞发酵提供了个不同的方法克服辅助因子阻碍：这种阻碍是因为活体总是提供自然循环时所需要的所有要素。因此可以避免蛋白质提纯这个繁琐的过程，并且也不被酶可能有的不稳定性的所限制。多数情况下，细胞的培养和贮存是很容易的，因此代表这个催化实体是可恢复的资源。 我们研究组发现微生物菌株的全细胞（长蠕孢菌CIOC3.3316）表现出像生物催化剂一样的高的羟化酶的活性，将组成一个新的微生物羟基化系统。反映条件，电子和立体作用与芳香族和脂肪族羧酸酯区域及对映选择的羟基化作用之间的相互关系也在研究中。 2.2 还原 表2中概述了对发生还原反应的微生物进行筛选的结果。对41种微生物菌株还原产率的评估，其中10种菌催化还原酮酯3生成相应的羟基酸酯4，产率很高（90%，菌株3-12）；这其中的6种菌（念珠地丝菌 CIOC2.616, 念珠地丝菌 CIOC2.1062, 念珠地丝菌 CIOC SY1, 酿酒酵母 CIOC2.1396, Yarrowia lipolytica CIOC 2.1506）还原酮酯1生成相应（R）-扁桃酸酯，对映选择性高（对映体过量90%-95%，菌株3-5，7，9，11）。对于立体选择，八种菌（毛孢子菌 CIOC2.25, 念珠地丝菌 CIOC2.1080, 念珠地丝菌 CIOC2.616, 念珠地丝菌 CIOC2.1062, 念珠地丝菌 CIOC SY 1, 酿酒酵母 CIOC2.1396, Yarrowia lipolytica CIOC 2.1506）遵循“Prelog原则”生成（R）-扁桃酸盐，并且没有任何一种菌株表现出反Prelog特异性生成（S）-扁桃酸盐。这些结果符合“Prelog原则”。这个简单的模型说明大部分的脱氢酶将氢阴