毛细管电泳在氨基酸分析中的应用.docVIP

毛细管电泳在氨基酸分析中的应用 大连大学环境与化学工程学院 化学112 刘纪程 1.概述 毛细管电泳（Capillary electrophoresis，CE） 又称高效毛细管电泳（HPCE） 或毛细管电分离法（CESM），是经典电泳技术和现代微柱分离相结合的产物。毛细管电泳(CE)的应用包括很多内容。已在生命科学、生物工程、医药、环境保护、食品检验等领域获得了广泛应用。被分析的物质有离子、小分子、生物大分子乃至高分子和粒子的分析；分析对象从无机物、有机物、生物体系乃至活体单个细胞的分析；含量测定范围可从常量到微量乃至几个分子的测定电泳技术是蛋白质分离的重要手段，而毛细管电泳技术一经发明，就在多肽、蛋白质等生物活性物质的分离分析方面显示出了巨大的优越性。 1.2 CE 的分离模式 CE 基于分离介质和分离原理的不同，常见的有以下几种分离模式[1， 2]：此外，还有毛细管矩阵电泳（CAE）、芯片式毛细管电泳（CCE） 及非水毛细管电泳（CNACE） 等，对于蛋白质和多肽的检测而言，应用最多的还是CZE和CIEF 这两种。近年来，一些新型的电泳溶剂也得到了应用，如非水相的或者水相+ 有机相的电解液、等电点缓冲溶液，离子性液体也被用于电泳分离，这大大拓展了其应用范围[3] 1.3 CE 的检测技术 由于CE 进样量小的特性，对检测器的灵敏度要求很高，通常采用柱上检测。在蛋白质和多肽的检测中，因为芳香类氨基酸有紫外吸收，故常用紫外检测器；在样品含量较低时，可采用荧光或者激光诱导荧光检测器；由于蛋白质溶液具有导电性，因此对毛细管进行改进以后，采用电导或安培电流也能检测出峰；另外，伴随蛋白质酶谱技术的发展，将CE 与质谱串联定性检测蛋白质水解后的多肽链的技术也得到了较快发展[4]。 2.氨基酸分析 由于只有少数几种氨基酸在紫外范围内有吸收，所以对氨基酸分析的主要问题在于检测方式。虽然也有报道用间接紫外、间接荧光、间接电化学、检测器测定未衍生化的氨基酸，但最灵敏的方法是采用荧光试剂将氨基酸衍生后再进行分离测定。已报道的衍生试剂有丹磺酰氯（DNS）乙内酰苯硫脲、萘二羧基醛、荧光异硫氰酸盐、邻苯二甲醛、 荧光胺、磺酰氯二甲胺偶氮苯、氯甲酸芴甲酯及苯羧基喹啉羧基醛。分离各种氨基酸衍生物的缓冲液常为磷酸、硼酸或混合液、少数用硼砂和TES一般均采用MEKC方式即加入SDS以增加选择性和分离度。还可加入甲醇、四氢呋喃或尿素等。检测方式有用UV 检测，但绝大部分均采用激光诱导荧光检测器。激发/发射波长常325/550nm和488/525可检测到amol甚至zmol水平的量。除了测定肽或蛋白经EDMAN降解后的氨基酸的量以外，还有用于测定酒、脑脊液及单个神经细胞中氨基酸的量。衍生方式同HPLC 一样，有柱前、柱后之分。商品仪器通常用柱前衍生。但对一些不够稳定的衍生试剂如OPA，应采用柱后衍生方式，至于D 和L型氨基酸的分离分析也有很多报道，有关内容将在CE手性分离的应用中介绍。 3. 结构分析 肽图是进行蛋白序列分析的第一步，随后可用CE进行微量制备，再测定各片断的氨基酸序列，即可得出整个蛋白的一级结构。现可用200μm内径的毛细管进行微量制备，一次就可进样90pmol的蛋白，所收集的片断量足够进行氨基酸序列测定。 用CZE 还可测定蛋白的物理参数，如测定了抹香鲸肌红蛋白的有效尺寸、电荷和扩散系数。所得的扩散系数和其它方法的结果相同??有效尺寸和晶体衍射的结果相同；用CE研究了马心肌红蛋白的血红素中Fe3+ 还原成Fe2+ 时的一级动力学速率。用CIEF测蛋白等电点比平板凝胶电泳测等电点的方法简单，可直接监测，速度快。已提出3 种CIEF方法来测定等电点，分辨度可达0.01pH单位或更小。 CE可用于肽和蛋白的结构分析。有65 个氨基酸的水蛭素（1-65），去掉谷氨酰胺的降解产物（1-64）和再去掉亮氨酸的降解产物（1-63），虽均为中性分子，但因C端酸的pK 不同而得以分离。Yuen 等用CE 监测一未知结构的肽STP-3和二硫苏糖醇的反应。整个反应体积只有2μL，足以供CE 监测几个小时的反应过程??发现淌度有所变化，结合序列测定和其它化学反应，可推测存在带二硫键的分支结构。 因CE 能将合成肽的C 端为酸和酰胺的两种形式加以分离，可确定STP-3 为含C端酰胺的一个二硫键的分支肽。这个推断随后得到了确证。相对于其它分析蛋白结构的方法而言，CE速度快、精度高，能很好地分离极相似的蛋白，如米曲霉核糖核酸酶T1的3 个突变体和宽范围的本底在pH 7.0条件下得以分离。突变体I（Gln-25→Lys）和突变体Ⅱ（Glu-58-Ala）及包括两个突变的突 变体III（Gln-25-→Lys，Glu-58-Ala），因其电荷和离子环境不同，使四者均得以分离。用C