酶的化学修饰基本原理及修饰酶的基本性质.docVIP

酶的化学修饰基本原理及修饰酶的性质特点 【摘要】 酶是高效生物催化剂，在工业、医学、科研等领域有着非常广泛的应用，尤其在工业生产中创造出巨大的经济效益。但由于酶是蛋白质，稳定性差且在生物体内具有较大的免疫原性，因而严重制约了其应用。对酶分子进行化学修饰是提高其稳定性的方法并且能够降低在生物体内的免疫原性，能够扩大其应用范围，极大地改善酶本质的不足。简要介绍酶的化学修饰基本原理及修饰酶的性质特点。 1 酶的化学修饰的基本原理 酶分子的化学修饰就是在分子水平上对酶进行改造，包括对酶分子主链结构的改变和对其侧链基团的改变。前者是分子生物学层次上的修饰，即在己知酶的结构与功能盖系的基础上，有目的地改变酶的某个活性基团或氨基酸残基，从而使酶产生新的性状，又称理性分子设计，理性分子设计主要应用于改造酶的底物特异性．催化特性以及热稳定性,Shaffer等通过将天冬氨酸转氨酶的Val39、Lys41、Thr47、Ash69、Thrl09和Ash297突变为酪氨酸转氨酶所对应的Lcu、Tyr、Ile、Leu、Set和Ser，修饰酶对Phe的活性增加3个数量级，而对Asp的活件没有影响，然而，由于酶的结构、功能和作用机制没自完全了解，而且仅仅把氨基酸序列的同源性作为氨基酸取代的标准，加上氨基酸取代后有可能导致没构想的改变，所以，并非所有理性分子设计都能取得预期效果，这就严重制约了理性分子设计的应用。 1. 1功能基团的修饰 酶分子可离解的基团如氨基(NH2)、羧基(～COOH)、羟基（OH)、巯基(sH)、咪锉基等都可用来修饰。脱氨基作用可改善酶的稳定性，消除酶分子表面的氨基酸的电荷，酰化反应，可改变侧链羟基性质。这些修饰反应，可稳定酶分子有利的催化活性现象，提高抗变性的能力。 1.2用表面活性剂对酶进行化学修饰 除糖基修饰外，也有人用表面活性剂对酶进行化学修饰。表面活性剂的亲水部分与酶连在一起，而亲油部分伸向有机溶剂，从而提高了酶在有机溶剂中的溶解度和分散度。Ken，chiMogi和Milsatoshi Nakajima发现表面活性剂HLB值和脂肪酸功能团部都显著影响酶的活性和产物的量。在有机溶剂中表面活性剂的疏水基团数目越多时对酶的修饰效果越好 1.3酶分子内和分子间的交联 双功能试剂如二异硫氰酸脂、戊二醛可与酶分子中或分子间肽链的两个游离氨基分别发生反应使它们交联起来，增加酶的稳定性和活性回收率。 1.4酶与高分子化合物结合 某些高分子化合物如蛋白质、多糖、聚乙二烯(PEG)等可以与酶结合，增加酶的稳定性，如淀粉酶在65℃时半衰期为25min，当与葡萄糖结合后，半寿期延长至63 min 1.5用化学衍生法修饰酶 随着分子生物学的进展，目前已能用多种方法随机突变产酶基因DNA，再与合适的载体(细菌)进行表达，并且构建了突变基因库来改进传统的筛选方法(将所有的细菌分别从琼脂板上取出再移至含营养液的板上培养繁殖，产生大量酶后再进行催化实验)。Pleltner等引用组台法制备并筛选化学衍生化的枯草溶菌RL酶。利用该酶与硫甲磺酸试剂(MTS)反应的定量、快速以及几乎不发生变性的特点，将酶中的3个关键活性位点分别与7种MTS试剂在96孔平板上分别进行组合衍生化，并按标准酶活力测定方法快速测定它们作为脂肪酸计酰胺酶的催化活性，初步得到分别具有最佳脂酶及酰胺酶的改良催化剂 2 修饰酶的性质特点 2.1 增强酶的稳定性 尹亮等利用PEG6000修饰SOD、发现修饰酶在70℃下保温3h后活性残余率比天然SOD高37.2%。Gomez等利用壳聚糖修饰酵母蔗糖酶，发现修饰酶在65℃、0.05mol发现修饰酶在65℃、0.05 mol／L的pH5．0HAc—NaAc缓冲液中的半衰期为5 h．而人然酶在相同条什下的半哀期为5 min；同时，修饰酶蛋白变性剂的抵抗能力也有所提高．在30℃、0 05 mol/l到6 mol／I．尿素的pH5. 0 HA-NaAc缓冲液中保温120 min后，大部分酶基本上已经没有活力，而修饰酶还有50％的活力，化学修饰酶稳定性提高的原因，可能是由于修饰剂共价连接于酶分子后，使酶天然构象产牛一定的刚性，不易伸展失活，并减少丁酶分子内部基团的热振动．从而使酶的热稳定性得到提高。 2.2 降低甚至消除酶的免疫原性 Hafsat等利用右旋糖汁修饰L-天门冬酰胺酶Ⅱ．发现修饰酶对用天门冬酰胺酶免疫活性的兔抗血清的结合能力明显弱于天然酶。舒薇等利用m—PEG修饰木瓜凝乳蛋白酶，发现随着酶的修饰程度的上升．术瓜凝乳蛋白酶的免疫原性逐渐下降甚生完全消除。目前认为，蛋白质的免疫原性是由于其分子上的抗原决定簇决定的，而抗原决定簇大多数有亲水氨基酸组成。用线性亲水性高分子物质(如右旋糖苷m-PEG等)与蛋白质表面的非必要基团共价偶连形成一种屏蔽，将