转染hTERT基因对人角膜内皮细胞增殖及功能维持的影响.pdfVIP

广东医学 2016年4月第37卷第7期 GuangdongMedicalJourn~ Apr．2016，Vo1．37，No．7 · 965 · 转染 hTERT基因对人角膜 内皮细胞增殖及 功能维持的影响术 刘志平 ，沙翔垠 ，王智崇 ，庄菁 广州医科大学附属第二 医院眼科 (广州 510260)； 中山大学中山眼科 中心、眼科学国家重 点实验室 (广州 510060) 【摘要】 目的 探索转染人端粒酶催化亚单位 (TERT)促进人角膜 内皮细胞(HCECs)增殖并进行长期培养 的可行性 。方法 原代 HCECs生长到8O％融合时，采用脂质体介导的方法将质粒 pEGFP—NI和 pBABE—puro— hTERT转染到HCECs，1 g／mL嘌呤霉素筛选。RT—PCR和Westernblot检测嘌呤霉素耐药克隆中TERT的表达 情况。阳性克隆进行传代培养。M1Tr法和细胞周期检测比较细胞的生长增殖能力：透射电镜检测细胞的超微结 构，RT～PCR检测泵功能相关基因的表达，Westernblot检测Na ／K 一ATPase01【的表达，免疫荧光检测ZO一1、 N—cadherin的表达。结果 TERT—HCECs表达了外源的TERT已经传到36代 ，保持了正常的HCECs形态且比 HCECs具有更强的增殖能力；泵功能相关基 因、Na ／K ATPase仅1、ZO一1的表达在TERT—HCECs和HCECs中 差异无统计学意义。TERT—HCECs能形成单层结构，并保持与原代 HCECs细胞相似的泵功能。结论 通过转染 TERT，建立了一株与原代生理功能相近且具有更强增殖能力的TERT—HCECs。 【关键词 】 人角膜 内皮细胞；端粒酶；端粒酶催化亚基；增殖；组织工程角膜 人角膜 内皮细胞 (humancornealendothelialcells， 1．2 pBABE—puro—hTERT的转染与克隆的筛选 HCECs)来源于与神经板分离的神经嵴细胞，位于角膜 当原代 HCECs生长到 80％融合时，用 LipofeetamineMT 最内面，前面与后弹力层相连 ，后面接触房水 ，是一层 2000转染 pBABE—puro—hTERT。转染实验 DNA和 六角形立方上皮细胞。HCECs通过屏障功能和水泵机 Lipofeetamine删2000按照Lipofectamine删2000的说明书 制保持角膜的透明性…，其在体内不能增殖 ，伴随着 进行，并作改进：细胞只与脂质 $／／质粒混合物在 年龄的老化 、眼外伤 、手术 、配戴角膜接触 37oC、5％CO，条件下孵育3h。24h后，转染的细胞在 镜 “、炎症 等因素，HCECs的数量在逐渐减少。一 含有 1 g／mL嘌呤霉素的HCECs培养液中进行筛选 些角膜内皮疾病比如FuchS角膜内皮营养不良 、人 培养。嘌呤霉素耐药克隆通过标准稀释法获得并采用 工晶体眼大疱性角膜病变… 可导致剩下的HCECs代 RT—PCR和 Westernblot检测 TERT的表达。阳性克 偿性扩大和不可逆性的HCECs失代偿。 隆(TERT—HCECs)进行传代和扩增培养 以进行后续 本研究2013年 1月至2015年 11月试图通过转染 的研究。 TERT而不是病毒癌基因来建立遗传学稳定的、非永生 1．3 形态学特点 每天光镜下观察细胞的生长情况， 化的HCECs细胞系。在获得的细胞系里，TERT不仅 包括细胞的形态、大小、生长状态、生长速度和有无污 延长了HCECs的增殖寿命 ，也使 TERT—HCECs保持 染等。将细胞接种在Ⅳ型胶原酶包被的不同的盖玻片 了HCECs的正常生物学特性。这将有益于将来组织 上 ，待生长到融合状态时，PBS清洗 3次，4％戊二醛 固 工程角膜构建的研究。 定 ，梯度酒精脱水，临界点温度干燥，透射 电镜观察细 1 材料与方法 胞表面结构 到(n=3)。 1．1 人角膜供体和HCECs的原代培养 人角膜供体 1．4 间接免