鼻咽癌细胞株---sp细胞获得的优化处理.doc

鼻咽癌细胞株侧群细胞染色条件的优化及其表面标记物的测定 焦锋，邱际华，张千兵，姚开泰，刘求真*（南方医科大学肿瘤研究所，广东广州 510515） 提要：目的 探讨鼻咽癌细胞株侧群细胞所需荧光染料Hoechst33342最佳的孵育时间和浓度。研究细胞密度对侧群细胞比例的影响，并测定其表面标记物CD133和ABCG2蛋白的表达 方法 荧光染料Hoechst33342孵育细胞，选择不同的时间（30，60，90，120，150，180 min）及不同的浓度，用流式细胞仪检测，倒置荧光显微镜观察选择合适的孵育时间和浓度。选取不同生长密度的细胞（70%，100%），流式细胞仪检测侧群细胞比例的变化。荧光抗体CD133和ABCG2共孵育Hoechst33342, 流式细胞仪测定细胞表面标记物CD133和ABCG2蛋白的表达 结果 Hoechst33342孵育时间为70min,侧群细胞染色效果较佳。不同的鼻咽癌细胞株，合适孵育终浓度不同, 如CNE2为6mg/ L，而CNE1为2mg/L。另外，侧群细胞的比例呈生长密度依赖性。CD133蛋白总含量恒定在0.1%~0.2%，侧群细胞和主群细胞表达量没有显著差异，CD133并不富集于侧群细胞中。而ABCG2蛋白，则侧群细胞较主群细胞优势表达，比例达80%以上。结论 鼻咽癌细胞株侧群细胞最佳的荧光染料染色时间为70 min，不同细胞株孵育终浓度不同。侧群细胞的比例呈密度依赖，与ABCG2密切相关，与CD133关系尚未明确，需进一步研究。 关键词：侧群细胞；主群细胞；肿瘤干细胞；流式细胞仪；Hoechst33342；鼻咽癌 中图分类号：R73-3 文章标识码 A 侧群( side population , 简称SP) 细胞是一类富集的干细胞， 主要表达ABC 转运蛋白（ATP-binding cassette transporter）家族成员ABCG2/ Bcrpl(ATP-binding cassette superfamily G member2/breast cancer resistance protein 1) ，现已经在多种正常组织和癌细胞株被发现。侧群细胞具有自我更新，多向分化潜能和修复组织的功能,肿瘤细胞株中的侧群细胞还具有强大的致瘤能力和耐药能力, 可能是肿瘤复发和耐药的根源。本实验主要研究获得鼻咽癌细胞株SP细胞染色条件的优化，细胞密度对SP细胞比例的影响，并测定其表面标记物ABCG2,CD133蛋白的表达，初步探讨三者之间的关系。 1. 材料与方法 1. 1 细胞株与试剂 鼻咽癌细胞株CNE2，CNE1，5-8F，6-10B，HONE1，SUNE1等(由本实验室保种)，HK-1（由香港中文大学医学院陶谦教授惠赠），RPMI1640培养液（Hyclone公司），2.5 g/L胰酶，胎牛血清(杭州四季青)，Hoechst33342，Verapamil(sigma)，PE-CD133抗体(Miltenyi Biotech)，PE-ABCG2抗体（eBioscience）等。 1. 2 仪器 FACSAria流式细胞仪(BD公司)，倒置荧光显微镜，倒置生物显微镜(Nikon)，低温高速离心机，CO2恒温细胞培养箱（Harris公司），台式低速离心机,恒温循环水浴箱（Pharamcia公司），超净工作台（苏州净化）等。 1. 3 细胞培养 鼻咽癌细胞株，用含100 ml/L 胎牛血清的RPMI1640培养液，在37 ℃，50 ml/L 饱和湿度条件下培养， 2.5 g/L胰蛋白酶消化传代，试验选用对数生长期细胞。 1. 4 细胞计数和染色 1. 4 .1 细胞计数 倒置生物显微镜下观察细胞生长状态良好，吸去培养基，D-hanks洗2遍，加入2.5 g/L胰蛋白酶，37℃恒温孵箱孵育2~3 min，待大量细胞变圆，加入完全培养基,吸管吹吸数次，移入10 ml锥形离心管中，细胞计数板计数，低速离心机300 r/m离心5 min，用20 ml/L胎牛血清的RPMI 1640培养液重悬细胞，调整密度为（0.5~1.0）×106 /ml。 1. 4. 2荧光染料Hoechst33342染色 不同的孵育时间 加入Hoechst33342至终浓度5 mg/L， 37℃恒温水浴箱避光水浴30，60，90，120，150 min， 每隔10 min混匀一次。4℃低温高速离心机3000 r/m离心2 min。弃上清，D-hanks洗二次，重悬于预冷的20 ml/L胎牛血清的D-hanks液中。对照组提前加入Verapamil至终浓度50μmol/L 37℃孵箱孵育30 min，期间每隔10 min混匀一次，后共孵育Hoechst33342。流式细胞仪分析，倒置荧光显微镜下观察细胞染色效果，选择合适