第二章-3-目的基因获得-9.15.pptVIP

基因组文库的保存 影印滤膜保存法 1）影印滤膜保存法： 2）保存文库于液体培养基中 从平板上挑取全部克隆，接种于含适当抗生素的液体培养基中，混合的细菌生长数代后，加入终浓度25%的甘油，-70℃保存。 缺点：由于文库菌落生长的不均匀性，可能导致文库中某些特定序列过多或过少。 3）保存单个克隆子于液体培养基中 从平板上挑选单个克隆，接种于含适当抗生素的液体培养基中，菌体生长至一定浓度时，加入终浓度25%的甘油，-70℃保存。 缺点：需保存的克隆子数过多，工作量大。 从基因组文库中筛选目的基因 大型基因组文库由数十万甚至上百万个重组克隆组成，除一些具特殊功能的蛋白质编码基因（如抗药性基因）可用特殊的正选择筛选程序（如抗药性筛选）直接筛选外，一般均需多轮操作步骤。 密集铺板（1-10万） 杂交 挖取 铺板 目的重组克隆 铺板 根据目的基因已知核苷酸序列进行筛选 通过构建基因组文库获取目的基因的问题： 该方法仅适用于原核基因的分离，较少采用。 不能除去真核生物目的基因的内含子结构。 工作量大，需了解目的基因的背景知识； 不能获得最小长度的目的基因； “鸟枪法(shotgun)”：又称“散弹法” 用限制酶部分酶切染色体DNA 将酶切片段克隆入载体 转化受体细胞并扩增 分离带有目的基因的DNA片段 筛选目的重组子 用“鸟枪法”获取目