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血小板源性伤口愈合因子对伤口组织细胞增殖作用的实验研究 文章来源： 　　　　 2006-7-26 16:32:35 ? 血小板源性伤口愈合因子对伤口组织细胞增殖作用的实验研究 中国修复重建外科杂志 1998年第4期第12卷 创面愈合 作者：张　艳*　陈荣德*　朱旭东* 单位：*　第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所一室(重庆，400042) 关键词：血小板源性伤口愈合因子；成纤维细胞；表皮细胞；增殖 　　　摘　要　　为了观察不同浓度的血小板源性伤口愈合因子(PDWHF)对伤口成纤维细胞及表皮细胞增殖能力的影响，并探讨其可能的机理，利用离体培养的鼠伤口成纤维细胞及人伤口表皮细胞为模型，将培养细胞分为三组，空白对照组：基质处理组(BM，成分为1640+0.5% fCS)；阳性对照组：1640+10%FCS；PDWHF组：BM+1%PDWHF、BM+3%PDWHF、BM+5%PDWHF、BM+7%PDWHF、BM+10%PDWHF及BM+12%PDWHF。待测样本与细胞共孵育48小时后，MTT法测定细胞的增殖情况。结果表明，PDWHF的浓度为1%～7%时，可显著促进伤口成纤维细胞及表皮细胞的增殖，明显高于0.5%FCS组(P＜0.01)；PDWHF的浓度为10%时，其促增殖作用已不再明显，与0.5%FCS组无显著差异(P＞0.05)；PDWHF的浓度为12%时，其只对伤口成纤维细胞的增殖呈现出明显抑制作用。认为，PDWHF是多种生长因子的混合物，在一定的浓度范围内对伤口成纤维细胞及表皮细胞有明显的促增殖作用，但当其浓度过高时促增殖作用不明显，甚至有抑制作用。 　　导致伤口不愈合的机理十分复杂，至今尚不完全清楚，创面生长因子种类、数量失调是其中的重要环节［1］。外源性生长因子如转化生长因子(transforming growth factors, TGFα/β)、血小板源生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF)、a/b成纤维细胞生长因子(a/b fibroblast growth factor, a/bFGF)能明显促进伤口愈合。文献报道，在 HYPERLINK /jbzt/nk-1/dxk-1/tnb-2/index.htm \t _blank 糖尿病患者难愈性伤口愈合过程中，PDGF、TGFα/β、bFGF、胰岛素样生长因子-Ⅰ、Ⅱ(insulin-like growth factor, IGF-Ⅰ，Ⅱ)、表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)等生长因子的相互配伍使用，可显示出良好的促愈合效果［2～8］。血小板源性伤口愈合生长因子(platelet derived wound healing factor, PDWHF)是来源于血小板脱颗粒时所释放的含多种生长因子的混合提取物，其主要成分为PDGF、IGF-Ⅰ、EGF、TGFα/β等，但对PDWHF促愈合机理的研究国内外尚不多见。我们的实验将重点探讨 PDWHF对伤口不同类型的组织修复细胞的促增殖作用及其可能的机理。 　　1　材料与方法 　　1.1　PDWHF液的制备 　　取人新鲜血小板浓缩液，以缓冲液充分洗涤后调成浓度为1×109/ml的细胞悬液，加入凝血酶(1 U/ml)，离心去除纤维蛋白和残余血小板，上清液经80℃温育30分钟后，再离心除去热变性蛋白，考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，制成5 mg/ml的PDWHF应用液，-20℃贮存备用。 　　1.2　伤口成纤维细胞的培养及传代 　　按我们建立的方法［9］培养伤口成纤维细胞：随机取体重18 g～20 g的小鼠2只，双侧后肢肌注0.2 ml 1%无菌甲醛液，致伤5天后活杀小鼠。无菌条件下剪取损伤的肌肉组织，经Hanks液和1640培养液(20% FCS、青霉素100 U/ml、链霉素100 μg/ml)各洗涤一次后，剪成大小为0.5 mm3～1 mm3的碎块，加入适量1640液，37℃、5%CO2培养箱中孵育2小时～3小时，组织块贴壁后，以1640培养液洗涤组织块一次，弃掉未贴壁者，加入适量的1640培养液相同条件下培养；7天～9天后成纤维细胞可生长融合成片，期间换液二次。 　　生长融合的细胞经0.25%胰蛋白酶消化30秒，倾去消化液，加入1640液洗涤二次，用1640培养液将细胞调成细胞悬液，浓度为1×104/ml，点接细胞悬液100 μl到96孔培养皿中，37℃、5%CO2条件下孵育12小时，吸去培养液，按加入的孵育液不同，将培养细胞分为三组，空白对照组：基质(basic medium, BM)处理组,成分为1640+0.5%FCS；阳性对照组：1640+10%FCS；PDWHF组：BM+1%PDWHF、BM+3%PDWHF、BM+5%PDWHF