类风湿性关节炎的基因治疗研究进展.docVIP

类风湿性关节炎的基因治疗研究进展 摘要：类风湿性关节炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是一种以关节滑膜炎为特征的慢性全身性自身免疫性疾病。限制了免疫系统的功能，导致机体更容易被其他病毒侵袭，也容易感染’-gag-pol-env-3’，两端存在长末端重复区（LTRS）用于介导病毒的整合，env基因中含有病毒包装所必需的序列。反转录病毒载体具有转染率高，可稳定整合表达、宿主范围广泛及对宿主的毒性小等优点，在RA的基因治疗中，以反转录病毒作为载体已取得很好的治疗效果。用编码MT1-MMP反义RNA的重组反转录病毒转染RA患者的滑膜成纤维细胞60d后进行定量PCR、Western blot和免疫组化染色检测得MT1-MMP反义mRNA是对照组的15倍，其蛋白的水平大大降低，关节软骨的损伤和炎症也有很大的减轻［1］。其不足的是，逆转录病毒只能转染处于分裂增殖期的细胞，其与受染细胞的整合具有随机性，有潜在的危险性，因此，若要将其安全应用于人体，还需进一步改造。 腺病毒载体 腺病毒是无包膜的线性双链DNA病毒，其基因组长约36kb，含有早期转录区（E1、E2、E3、E4）和晚期转录区（L1、L2、L3、L4、L5）。E1基因位于基因组的1.0~1.6基因图距单位（Mu），为病毒复制的必须区，缺失E1基因的腺病毒为复制缺陷的腺病毒载体。E3区位于基因组78~86Mu，是病毒复制的非必须区，可作为外源基因的插入区。腺病毒载体通常缺失E1和E2区域。作为基因治疗的载体，腺病毒载体具有以下显著优点：（1）基因组大，可插入大片段的外源基因（至多可达35kb）；（2）可高效地转染不同类型的人组织细胞（体外实验转染效率通常接近100％）；（3）可转染非分裂的细胞；（4）在细胞培养物中有高滴度的重组病毒产量（1014/L）；（5）进入细胞后并不整合到宿主细胞的基因组中，仅瞬间表达，因而安全性较高，由于腺病毒载体具有上述优点，故在RA的基因治疗中被广泛应用。将能表达凝血酶敏感素-1（TSP-1）的腺病毒载体 （AdTSP-1）的鼠关节内注射胶原诱导的关节炎（CIA）模型［2］，与对照组相比较，其CIA的严重程度降低，血管内皮生长因子（VEGF）生成量减少，TSP-1和转化生长因子-β(TGF-β)的生成量增加，滑膜肿胀得到抑制，CIA可得到很大的改善。能表达IL-13的腺病毒载体在RA模型中降低促炎性细胞因子的生成，足肿胀体积减少，骨损伤减弱，单核细胞、淋巴细胞和多形核细胞数量等关节炎症的指标明显下降，炎症得到明显改善；而腺病毒由于其基因组复杂，难以构建包装细胞系因而使之应用受到一定的限制。 1．3 疱疹病毒载体 1型单纯疱疹病毒（HSV-1）属于人嗜神经病毒，可在神经元细胞内建立潜伏转染。HSV-1可被改造成两类载体：一是扩增子（amplicon）载体，即仅把HSV-1的复制起点和包装信号序列插入到细菌的质粒中。当其转染至包装细胞后，用HSV-1辅助病毒超转染，便可获得含有扩增子的假病毒。另一类为重组的HSV-1，即删除了与复制相关的非必需基因，以减少其对细胞的毒性，可用于在宿主神经元细胞中长期表达外源性治疗基因。但如果宿主的神经元细胞中已潜伏了野生型HSV，就很可能重新激活病毒而进入裂解期。松鼠猴疱疹病毒（squirrel herpes virus，SHV）是疱疹病毒家族中的一员，为双链DNA分子结构，比较容易转染哺乳动物的细胞。SHV载体是第一个被应用的基因治疗载体。体内外的实验均证明SHV载体携带的目的基因可在靶组织中长期持续表达。用编码可诱导抗炎性细胞因子生成基因的重组SHV载体转染RA大鼠成纤维滑膜细胞，可检测到IL-10的生成较对照组明显升高，IL-1β诱导的基质金属蛋白酶-3（MMP-3）的生成量较对照组明显下降，RA炎症得到明显改善［3］。 2 基因治疗方法 基因治疗是将正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入靶细胞以纠正基因的缺陷而发挥治疗作用，从而达到治疗目的的生物医学高技术。 2．1 RNA干扰靶向TNF基因 研究证明肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)是类风湿关节炎(RA)发病机制中居于中心地位的促炎症细胞因子，参与RA的发生发展过程。TNF的非正常表达对类风湿关节炎的产生和发展起着非常重要的作用。数据表明，RA炎症程度与TNF水平高度相关。免疫组化研究结果显示，80％以上的RA滑膜组织有抗TNF抗体着染的细胞。在软骨和血管连接处的细胞也表达TNF，提示它可能影响软骨细胞的代谢，导致软骨的破坏。抑制TNF的产生将会部分阻断类风湿关节炎的炎症反应，更好的保护病人的关节软骨。 近年来发现将与mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA(double—strand