EMSA实验方案翻译.docVIP

下载本文档

10
0
约5.06千字
约 4页
2017-08-21 发布于重庆
举报
版权申诉

EMSA实验方案翻译.doc

1、原创力文档（book118）网站文档一经付费（服务费），不意味着购买了该文档的版权，仅供个人/单位学习、研究之用，不得用于商业用途，未经授权，严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等，侵权必究。。
2、本站所有内容均由合作方或网友上传，本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺！文档内容仅供研究参考，付费前请自行鉴别。如您付费，意味着您自己接受本站规则且自行承担风险，本站不退款、不进行额外附加服务；查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档，您可以点击这里二次下载。
3、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等，请点击“版权申诉”（推荐），也可以打举报电话：400-050-0827(电话支持时间：9:00-18:30)。
4、该文档为VIP文档，如果想要下载，成为VIP会员后，下载免费。
5、成为VIP后，下载本文档将扣除1次下载权益。下载后，不支持退款、换文档。如有疑问请联系我们。
6、成为VIP后，您将拥有八大权益，权益包括：VIP文档下载权益、阅读免打扰、文档格式转换、高级专利检索、专属身份标志、高级客服、多端互通、版权登记。
7、VIP文档为合作方或网友上传，每下载1次，网站将根据用户上传文档的质量评分、类型等，对文档贡献者给予高额补贴、流量扶持。如果你也想贡献VIP文档。上传文档

EMSA实验方案翻译

第一次EMSA实验实验设计首次实验为确保系统的正确工作和操作的正确性，设计将Control System和Test System一起电泳。聚丙烯酰胺凝胶泳道共10个，“#number”表示泳道序号。 Table 1. Control reactions for the expected results. Component Final Amount Control Reactions #1 #2 #3 Ultrapure Water 12 μl 11 μl 9 μl 10×Binding Buffer 1× 2 μl 2 μl 2 μl 50% Glycerol 2.5% 1 μl 1 μl 1 μl 100mM MgCl2 5 mM 1 μl 1 μl 1 μl 1 μg/μl Poly(dI·dC) 50 ng/μl 1 μl 1 μl 1 μl 1% NP-40 0.05% 1 μl 1 μl 1 μl Unlabeled EBNA DNA 4 pmol 2 μl EBNA Extract 1 Unit 1 μl 1 μl Biotin-EBNA Control DNA 20 fmol 2 μl 2 μl 2 μl Total Volume 20 μl 20 μl 20 μl Table 2. Binding reactions for the Test System. Component Final Amount Reactions #4 #5 #6 #7 #8 #9 #10 5L1D 5L6D W0 PP P0 P3 Ultrapure Water 10×Binding Buffer 1× 2 μl 2 μl 2 μl 2 μl 2 μl 2 μl 2 μl 1 μg/μl Poly(dI·dC) 50 ng/μl 1 μl 1 μl 1 μl 1 μl 1 μl 1 μl 1 μl Optional: 50% Glycerol 2.5% 1 μl 1 μl 1 μl 1 μl 1 μl 1 μl 1 μl Optional: 1% NP-40 0.05% 1 μl 1 μl 1 μl 1 μl 1 μl 1 μl 1 μl Optional: 1M KCl Optional: 100mM MgCl2 5 mM 1 μl 1 μl 1 μl 1 μl 1 μl 1 μl 1 μl Optional: 200 mM EDTA Unlabeled Target DNA 4 pmol Protein Extract 2 μg Biotin End-Labeled Target DNA 20 fmol Total Volume 20 μl 20 μl 20 μl 20 μl 20 μl 20 μl 20 μl 进一步实验根据第一次实验结果，不同时期探针结合情况不同，以另外两批材料的核蛋白重复实验各一次；若实验结果显示某个时期结合较为明显，可选择结合最显著的时期的核蛋白进行下一步竞争实验验证，设计不同浓度梯度的Unlabeled Target DNA(cold probe)特异性竞争结合，排除非特异性结合的可能；最后在与探针结合的蛋白的位置凝胶切下测序。实验准备 2.1 试剂 500 ml 5×TBE（0. μm水系滤头过滤）……………………27 g Boric acid………………………13.75 g 0.5 mol/L EDTA-Na+(pH 8.0)…10 ml或直接加Na2EDTA·2H2O…………1.86 g 超纯水400 ml 溶解，定容到500 ml，室温保存，使用前用0.22 μm水系滤器过滤；40% Acrylamide（丙烯酰胺/甲双叉丙烯酰胺：19﹕1）： Acrylamide………………………9.5 g BIS………………………………0.5 g 超纯水10 ml 溶解，定容至20 ml，0.45 μm水系滤器过滤，于棕色瓶中4℃保存；显影液定影液10% AP（过硫酸铵；不可使用过旧的）: AP………………………………0.1 g 去离子水………………………..1 ml 溶解后储存于4℃，2周内有效； 50 ml 5 M NaCl： NaCl…………………………14.61 g 去离子水…………………….40 ml 溶解，定容至50 ml，高温高压灭菌，4℃保存； 50 ml 0.5 M EDTA (pH 8.0)： Na2EDTA·2H2O…………