食物中生物素.DOC

食物中生物素（维生素H）的测定方法 微生物测定法 1.原理 生物素对于Lactobacillus plantarum（ATCC 8014）的正常生长是一种必需的营养素，在一定 生长条件下，Lactobacillus plantarum 的生长与繁殖速度与溶液中生物素的含量成一定的线性 关系，通过利用浊度法或光密度法测定细菌生长和繁殖的强度可间接地测定出食物样品中的生 物素含量。最低检出限为0.003ng。 2.适用范围 本方法参考Official Methods of Analysis of the Association of official Analytical Chemists、Methods of Vitamin Analysis以及Methods of the Microbiological Analysis of Selected Nutrients。本方法适用于测定各类食物及饲料中的生物素含量。 3.试剂 本试验所用水均为蒸馏水，所用试剂均需分析纯试剂。 3.1 甲苯。 3.2 1 mol/L 硫酸溶液：在600ml 水中加入55.6ml 浓硫酸，稀释至1000ml。 3.3 3 mol/L 硫酸溶液：在600ml 水中加入166.7ml 浓硫酸，稀释至1000ml。 3.4 10mol/L 氢氧化钠溶液：溶200g 氢氧化钠于水中，定容至500ml。 3.5 1：1（1+1）乙醇溶液：500ml 无水乙醇与500ml 水充分混匀。 3.6 酸解酪蛋白：称取50g 不含维生素的酪蛋白于500ml 烧杯中，加200ml 3 mol/L 盐酸，121℃ 高压水解6 小时。将水解物转移至蒸发皿内，在沸水浴上蒸发至膏状。加200ml 水使之溶解后 再蒸发至膏状，如此反复3 次，以去除盐酸。以溴酚蓝作外指示剂，用10mol/L 氢氧化钠调节 pH 至3.5。加20g 活性炭，振摇，过滤，如果滤液不呈淡黄色或无色，可用活性炭重复处理。 滤液加水稀释至500ml，贮存于试剂瓶中，加少许甲苯于4℃冰箱中保存。 ? 酸解的目的是为了消除酪蛋白中的维生素，确保基本培养基中不含待测定的生物素，但有时 酸水解不一定彻底，所以一定要选用不含维生素的酪蛋白粉（最好为Sigma 公司产品），这样 可较好地确保酸解酪蛋白中不含生物素。 3.7 胱氨酸、色氨酸溶液：称取4g L-胱氨酸和1g L-色氨酸（或2g DL-色氨酸）于800ml 水中， 加热至70～80℃，逐滴加入1：5（1+5）盐酸，不断搅拌，直至完全溶解为止。冷至室温，加 水稀释至1000ml。加少许甲苯于4℃冰箱中保存。 3.8 腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶溶液：称取硫酸腺嘌呤（纯度为98%）、盐酸鸟嘌呤（生化试剂） 以及尿嘧啶各0.1g 于250ml 烧杯中，加75ml 水和2ml 浓盐酸，然后加热使其完全溶解，冷却， 若有沉淀产生，加盐酸数滴，再加热，如此反复，直至冷却后无沉淀产生为止，以水稀释至100ml， 贮存于试剂瓶中，加少许甲苯于冰箱中保存。 3.9 维生素溶液：称取20mg 核黄素，10mg 盐酸硫胺素，10mg 对氨基苯甲酸，40mg 盐酸吡哆醇， 用0.02mol/L 乙酸溶液溶解并定容至1000ml。 3.10 盐溶液：称取10g MgSO4 7H2O、1g KCl、0.5g MnSO4 4H2O，0.5g FeSO4 7H2O 加23 ml 85% H3PO4，用水溶解并定容至500ml。 3.11 生物素标准溶液 溶液名称 浓度 配置方法 标准 50μg / ml 称取25mg 无水生物素用（1+1）乙醇溶液定至500ml，于4 储备溶液 ℃冰箱中贮存。 标准 中间液Ⅰ 1μg / ml 取5ml 储备液用（1+1）乙醇溶液定容至250ml，于2-4℃冰 箱中贮存。 标准 中间液Ⅱ 10 ng / ml 取5ml 中间液Ⅰ用（1+1）乙醇溶液定容500ml，于2-4℃冰 箱中贮存 标准 工作液 1 ng / ml 取5ml 中间液Ⅱ用去离子水定容至50ml，在2-4℃冰箱中贮 3.12 基本培养基：将下列试剂混合于500ml 烧杯中，加水至200ml，以溴麝香草酚蓝作外指示 剂，用10mol/L 氢氧化钠液调节pH 至6.8，用水稀释至250ml。 酸解酪蛋白 25ml 胱氨酸、色氨酸溶液 25ml 腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶溶液 5ml 维生素溶液 5ml 盐溶液 5ml 无水葡萄糖 5g 无水醋酸钠 5g 此培养基也可从Difco 公司购得，产品号为No.0419-15-8。 ? 由于国内的某些试剂的纯度不够，所以自行配制的培养基较浑浊，且常有刺激细菌生长的物 质存在，因此严重影响到最后的浊度测定结果，建议使用商品化培养基。 3.12 琼脂培养基：在600ml