专题2 课题2 土壤中分解尿素细菌分离和计数.pptVIP

课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数;一.研究思路 ㈠.筛选菌株： 实验室中微生物的筛选原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。 要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等，采用选择培养分离的方法，或抑制使大多数微生物不能生长，或造成有利于该菌生长的环境，经过一定时间培养后使该菌在群落中的数量上升，再通过平板稀释等方法对它进行纯培养分离。;㈡.统计菌落数目： 1.直接计数法：这种方法是利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。此法的缺点是不能区分死菌和活菌。;2.间接计数法(活菌计数法)： ⑴原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。 ⑵常用方法：稀释涂布平板法。 ⑶注意事项;注意事项 ①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30——300的平板上进行计数。 ②为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数。 ③统计的菌落往往比活菌的实际数目低。这是因为两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。 ④涂布平板法所选择倒平板的稀释度很重要，一般以三个稀释度中的第二个稀释度倒平板所出现的平均菌落数在50个左右为最好。; 除上述两种常用的计数方法外，还有膜过滤法、比浊法。膜过滤法是当样品中菌数很低时，可以将一定体积的湖水、海水或饮用水等样品通过膜过滤器。然后将滤膜干燥、染色，并经处理使膜透明，再在显微镜下计算膜上(或一定面积中)的细菌数；比浊法原理是在一定范围内，菌的悬液中细胞浓度与混浊度成正比，即与光密度成正比，菌越多，光密度越大。因此可以借助于分光光度计，在一定波长下，测定菌悬液的光密度，以光密度表示菌量。实验测量时一定要控制在菌浓度与光密度成正比的线性范围内，否则不准确。微生物计数法，发展迅速，现???多种多样的快速、简易、自动化的仪器和装置等方法。 ;㈢.设置对照： 对照实验是指除了被测试条件以外，其他条件都相同的实验，其作用是比照实验组，排除任何其他可能原因的干扰，证明确实是所测试和条件引起相应的结果。设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。; P23讨论问题 A同学的结果与其他同学不同，可能的解释有两种。一是由于土样不同，二是由于培养基污染或操作失误。究竟是哪个原因，可以通过实验来证明。实验方案有两种。一种方案是可以由其他同学用与A同学一样的土样进行实验，如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。另一种方案是将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。;二.实验的具体操作 ㈠.土壤取样 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。 ◆取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。 ㈡.制备培养基： 制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。;㈢.样品的稀释：;P24旁栏思考题： 为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？ 答：这是因为土壤中各类微生物的数量（单位：株/kg）是不同的，例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。因此，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。;㈣.取样涂布;㈤.微生物的培养与观察;思考与讨论 在微生物培养过程中，为什么每隔24h统计一次菌落数目？菌种鉴定的依据是什么？ 答：不同种类的微生物，往往需不同的培养温度和培养时间，每隔24h统计1次菌落数目，选取菌落数目稳定时记录作为结果，这样可以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。不同种类的细菌形成的菌落，在大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等方面具有一度的特征，菌落特征可作为菌种鉴定的重要依据。;三.结果分析与评价 1.通过对照实验，若培养物有杂菌污染，菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出分解尿素的微生物。 2.提示：选择每个平板上长有30——300个菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。;四.课外延伸 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细