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第三章 基因工程常用的克隆载体 第一节 质粒载体 一、质粒的定义 存在于细胞质中的一类独立于染色体,并能自主复制的遗传成分(复制子) 质粒DNA编码的表型 抗性特性 二、质粒DNA分子的特性 结构特性 染料结合特性: 呈平面结构的染料(EB)可平嵌入DNA双链碱基对之间。cccDNA由于结构紧密,自由末端较少,可结合染料EB分子比L-DNA少,因此密度较大。 变性特性 cccDNA由于分子较小且结构紧密,碱性条件下变性后,恢复pH条件即可复性。 复制特性 三、质粒载体应具备的条件 具有复制起始位点 具有至少两种易被检测的选择性标记 具有多克隆位点(MCS) 四、几种常用的质粒载体 第二节 λ噬菌体载体 λ噬菌体DNA可以作为克隆载体的原因: 高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞 自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增 λDNA缺失达总量20%的DNA时,仍不影响其特性,可为外源基因提供装载空间 一、基本概念 噬菌体感染周期: 二、 λ噬菌体的形态结构及繁殖特性 形态结构 繁殖特性 三、 λDNA的结构及功能 cΙ基因:编码阻遏蛋白,使参与溶菌周期活动的基因失活 cΙ基因表达:溶源途径 cΙ基因不表达:溶菌途径 四、 λ噬菌体载体的构建 消除多余的限制性内切酶位点 点突变 基因组置换、缺失 增加单一酶切位点 去除非必要区段 λ噬菌体头部蛋白可包装DNA大小:75~105% λDNA长度(38~52kb) 增加筛选标记基因 五、 λ噬菌体载体的主要类型 插入型载体: λDNA缺失部分非必要基因,只含有一个或两个可供外源DNA插入的酶切位点 特点:承载能力较小(10kb) 筛选标记:基因插入失活 免疫功能失活的插入型载体 β-半乳糖苷酶基因失活的插入型载体 β-半乳糖苷酶失活的插入型载体 替换型载体: 又称取代型载体。在λDNA可替换片断两端具有两个限制酶位点,酶切后可替换片断与左右翼分开,由外源DNA片断取代 特点:承载能力大 筛选标记: λDNA大小 β-半乳糖苷酶基因替换 六、 l-DNA作为载体的优点 LOGO 载体的功能 运送外源基因高效转入受体细胞 为外源基因提供复制能力或整合能力 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件 复制子:细胞内独立存在的、能够自我增殖的结构单位 染色体DNA 质粒DNA 噬菌体DNA 抗生素抗性: 重金属抗性: 毒性阴离子: 其他: Ampr Cmlr Kanr Strr Tetr Hg、Ni、Co、Pd、Zn 砷酸盐、亚砷酸盐、硼酸盐、铬酸盐 嵌入试剂(EB、吖啶)、辐射、噬菌体 代谢特性: 修饰寄主生活方式: 植物冠瘿病、发根病 冠瘿碱代谢 SC型 共价闭合环形DNA(cccDNA,covalently closed circular DNA ) OC型 开环DNA(ocDNA,open circular DNA ) L 型 线性DNA(L-DNA,line DNA) 提取纯化质粒DNA: 氯化铯-溴乙锭密度梯度离心法(CsCl-EtBr) 质粒DNA纯度高、周期长、设备要求高、存在溴乙锭污染! 提取纯化质粒DNA: 微量碱变性法 裂解菌体细胞 加碱调pH至12~12.5 DNA变性 离心 加NaAc调pH至4.8 去除蛋白质、RNA 质粒DNA纯度较低、周期较短! 拷贝数:生长在标准培养基条件下,每个细胞中所含有的质粒DNA分子的数目 严紧型复制:1-2个 松弛型复制:10-100个 制备质粒:寄主细胞培养基中加入蛋白质合成抑制剂,增加质粒拷贝数! 多克隆位点(multi-cloning-site,MCS):多种常用限制酶单一识别序列所组成的DNA序列 具有尽可能小的相对分子质量 易于分离纯化 目的DNA装载能力强 拷贝数高 多重酶识别位点几率低 应属于松弛型复制 应为非传递型 pBR322 来源:大肠杆菌 Ori: 标记基因:apr、tcr 分子大小:4363bp 拷贝数:50-100/cell pBR322 4363 bp Origin of Replication ROP ROI Sal I BamH I Tc r Pvu I Pst I Pst I EcoR I Cla I Hind III Hind II Bal I Ap r pUC18 来源:大肠杆菌 Ori: 标记基因:apr、lacZ’ MCS: 分子大小:2686bp 拷贝数:1000-2000/cell E.coli 吸附 注入 复制 包装 裂解 整合 温和噬菌体 烈性噬菌体 原噬菌体 营养体 溶源菌 溶菌途径 溶源途
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