第三章-基因工程常用的克隆载体.pptVIP

第三章 基因工程常用的克隆载体 第一节 质粒载体 一、质粒的定义 存在于细胞质中的一类独立于染色体，并能自主复制的遗传成分（复制子） 质粒DNA编码的表型 抗性特性 二、质粒DNA分子的特性 结构特性 染料结合特性： 呈平面结构的染料（EB）可平嵌入DNA双链碱基对之间。cccDNA由于结构紧密，自由末端较少，可结合染料EB分子比L-DNA少，因此密度较大。 变性特性 cccDNA由于分子较小且结构紧密，碱性条件下变性后，恢复pH条件即可复性。 复制特性 三、质粒载体应具备的条件 具有复制起始位点 具有至少两种易被检测的选择性标记 具有多克隆位点（MCS） 四、几种常用的质粒载体 第二节 λ噬菌体载体 λ噬菌体DNA可以作为克隆载体的原因： 高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞 自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增 λDNA缺失达总量20%的DNA时，仍不影响其特性，可为外源基因提供装载空间 一、基本概念 噬菌体感染周期： 二、 λ噬菌体的形态结构及繁殖特性 形态结构 繁殖特性 三、 λDNA的结构及功能 cΙ基因：编码阻遏蛋白，使参与溶菌周期活动的基因失活 cΙ基因表达：溶源途径 cΙ基因不表达：溶菌途径 四、 λ噬菌体载体的构建 消除多余的限制性内切酶位点 点突变 基因组置换、缺失 增加单一酶切位点 去除非必要区段 λ噬菌体头部蛋白可包装DNA大小：75～105% λDNA长度（38～52kb） 增加筛选标记基因 五、 λ噬菌体载体的主要类型 插入型载体： λDNA缺失部分非必要基因，只含有一个或两个可供外源DNA插入的酶切位点 特点：承载能力较小（10kb） 筛选标记：基因插入失活 免疫功能失活的插入型载体 β-半乳糖苷酶基因失活的插入型载体 β-半乳糖苷酶失活的插入型载体 替换型载体： 又称取代型载体。在λDNA可替换片断两端具有两个限制酶位点，酶切后可替换片断与左右翼分开，由外源DNA片断取代 特点：承载能力大 筛选标记： λDNA大小 β-半乳糖苷酶基因替换 六、 l-DNA作为载体的优点 LOGO 载体的功能 运送外源基因高效转入受体细胞 为外源基因提供复制能力或整合能力 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件 复制子:细胞内独立存在的、能够自我增殖的结构单位 染色体DNA 质粒DNA 噬菌体DNA 抗生素抗性： 重金属抗性： 毒性阴离子： 其他： Ampr Cmlr Kanr Strr Tetr Hg、Ni、Co、Pd、Zn 砷酸盐、亚砷酸盐、硼酸盐、铬酸盐 嵌入试剂（EB、吖啶）、辐射、噬菌体 代谢特性： 修饰寄主生活方式： 植物冠瘿病、发根病 冠瘿碱代谢 SC型 共价闭合环形DNA（cccDNA，covalently closed circular DNA ） OC型 开环DNA（ocDNA，open circular DNA ） L 型 线性DNA（L-DNA，line DNA） 提取纯化质粒DNA： 氯化铯-溴乙锭密度梯度离心法（CsCl-EtBr） 质粒DNA纯度高、周期长、设备要求高、存在溴乙锭污染！ 提取纯化质粒DNA： 微量碱变性法 裂解菌体细胞 加碱调pH至12～12.5 DNA变性 离心 加NaAc调pH至4.8 去除蛋白质、RNA 质粒DNA纯度较低、周期较短！ 拷贝数：生长在标准培养基条件下，每个细胞中所含有的质粒DNA分子的数目 严紧型复制：1-2个 松弛型复制：10-100个 制备质粒：寄主细胞培养基中加入蛋白质合成抑制剂，增加质粒拷贝数！ 多克隆位点（multi-cloning-site，MCS）：多种常用限制酶单一识别序列所组成的DNA序列 具有尽可能小的相对分子质量 易于分离纯化 目的DNA装载能力强 拷贝数高 多重酶识别位点几率低 应属于松弛型复制 应为非传递型 pBR322 来源：大肠杆菌 Ori： 标记基因：apr、tcr 分子大小：4363bp 拷贝数：50-100/cell pBR322 4363 bp Origin of Replication ROP ROI Sal I BamH I Tc r Pvu I Pst I Pst I EcoR I Cla I Hind III Hind II Bal I Ap r pUC18 来源：大肠杆菌 Ori： 标记基因：apr、lacZ’ MCS： 分子大小：2686bp 拷贝数：1000-2000/cell E.coli 吸附 注入 复制 包装 裂解 整合 温和噬菌体 烈性噬菌体 原噬菌体 营养体 溶源菌 溶菌途径 溶源途