第十章-基因工程.pptVIP

第九章基因工程 mRNA cDNA 双链cDNA 重组DNA分子 cDNA文库 反转录酶 载体 受体菌 复制 * 从cDNA文库获取目的基因 逆转录酶 A A A A T T T T AAAA SI核酸酶 DNA聚合酶Ⅰ 碱水解 T T T T 引物 引物 3’ 5’ 5’ 5’ 3）PCR技术 基因组 2 载体DNA的选择 功能： 为目的基因提供进入受体细胞的转移能力。 为目的基因提供在受体细胞中的复制能力或整合能力。 为目的基因提供在受体细胞中的扩增和表达能力。 目的基因 整合在宿主细胞染色体DNA中 独立于宿主细胞染色体DNA外 （独立的复制子功能） 基因载体 （二）限制性内切酶酶切 切 酶切 接 （三）目的基因与载体的连接 磷酸二酯键的形成 DNA连接酶 DNA连接酶 DNA连接酶 连接方式： 粘性末端连接 平头末端连接 同聚物加尾连接 人工接头连接 1. 粘性末端连接 方式 同一限制酶切位点连接 不同限制酶切位点连接 Bam HⅠ切割反应 GGATCC CCTAGG T4 DNA连接酶 15oC GATCC G G CCTAG + 目的基因用 Bam HⅠ切割 载体DNA用Bam HⅠ切割 重组体 载体自连 目的基因自连 同一限制酶切位点连接 不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接 Eco RⅠ切割位点 Bg lⅡ切割位点 + EcoRⅠ+ Bg lⅡ 双酶切 Eco RⅠ+ Bg lⅡ 双酶切 T4 DNA连接酶 15oC 重组体 配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。 2. 平头末端连接 适用于 限制性核酸内切酶切割产生的平端 粘端补齐或切平产生的平端 目的基因 载体 限制性内切酶 限制性内切酶 T4 DNA连接酶 15oC 重组体 载体自连 目的基因 自连 3. 同聚物加尾连接 在末端转移酶(terminal transferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。 5′ 3′ 3′ 5′ 载体DNA 5′ 3′ 3′ 5′ 目的基因 限制酶或机械剪切 限制酶 5′ 3′ 3′ 5′ 5′ 3′ T(T)nT T(T)nT 3′ 5′ 5′ 3′ 3′ 5′ 5′ 3′ A(A)nA A(A)nA 3′ 5′ λ-核酸外切酶 λ-核酸外切酶 末端转移酶 + dATP 末端转移酶 + dTTP T(T)nT A(A)nA A(A)nA T(T)nT T4 DNA连接酶 15oC 重组体 4. 人工接头(linker)连接 由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。 人工接头及其应用 CCGAATTCG GGCTTAAGC 5′- 3′- Eco RⅠ Eco RⅠ Eco RⅠ Eco RⅠ 转 （四）重组体导入受体细胞 受体细胞 受体菌条件 安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷 处于感受态(competent) 导入方式 转化 (transformation) 转染 (transfection) 感染 (infection) 1. 原核细胞的转化（细菌转化） 1)受体细胞的选择 限制缺陷型: 避免修饰和降解 重组缺陷型：避免重组整合 转化亲和型：较高的可转化性 遗传互补型：利于筛选 感染缺陷型：防止感染 克隆载体 表达载体 原核表达载体 真核表达载体 报告载体 载体的分类 外源基因不表达 早期使用的克隆载体的典型代表 pBR322，目前已较少使用，多被用作构建新克隆载体的起始材料 pUC 由pBR322的氨苄青霉素抗性基因和复制子与大肠杆菌?-半乳糖苷酶?（lacZ?）基因融合而成 1.克隆载体 2.表达载体 含有强启动子的载体 外源基因可在启动子的控制下转录成mRNA，并最终以蛋白质的形式在宿主细胞中表达。 原核表达载体 真核表达载体 3. 报告载体 以一种易于用生化方法检测的基因作为报告基因，通过其表达强度的高低来研究外源调控因子（如启动子、增强子等）的功能。 常用的报告基因 pGL2 ：萤火虫荧光素酶 pCAT ：氯霉素乙酰转移酶 pSEAP：分泌型人胎盘碱性磷酸酶 （一）质粒 存在于细菌染色体外的小型环状DNA分子。 分子量小，能在细菌中稳定存在，有较高的拷贝数。 带有抗性基因及表型识别等遗传性标记物。 具有多个限制酶的