缺铁胁迫对海豚链球菌生长影响及铁转运蛋白基因(ftsABCD)克隆及表达.pdf

标题：缺铁胁迫对海豚链球菌生长的影响及铁转运蛋白基因 (冗斟蚴的克隆与表达 专业：水生生物学 姓名：王君 指导老师：李安兴教授 摘要 iniae)是一类重要的鱼类病原菌，由该菌引起 海豚链球菌(Streptococcus 的鱼类海豚链球菌病对当今世界的水产养殖业造成了巨大的经济损失。为了能 有效的控制海豚链球菌病，需要对海豚链球菌毒力因子进行深入研究，寻找有 效的抗原。铁元素是一种生命必须的营养元素，众多研究表明铁元素作为一种 重要的环境信号因子影响着细菌相关毒力基因的表达，另外，负责铁转运的复 合体属于ABC转运体家族，该转运体上的铁元素受体结合蛋白具有一定的抗原 性，能作为亚单位疫苗的候选者之一。基于上述原因，本文选择对海豚链球菌 进行铁胁迫以及铁转运基因的研究，希望能初步揭示铁元素对海豚链球菌的重 要作用，以及通过分子生物学方法找到海豚链球菌铁转运体并对受体蛋白的抗 原性进行验证，为亚单位疫苗的研制打下基础。 acidtrisodium salt，NTA) 本研究使用次氮基三乙酸钠盐(Nitrilotriacetic 作为铁螯合剂添加到脑心浸液培养基中人为制造缺铁培养环境，观察海豚链球 mM 菌的生长情况。结果表明：加入终浓度为5 NTA能够延缓海豚链球菌liD— l菌株对数生长期时间6hr，且静止期细菌密度是O．67，要显著小于对照组 mM 0．77，且革兰氏染色发现细菌形成长链状；加入终浓度为15NTA则完全抑 恢复生长。进一步分析不同条件下生长的海豚链球菌细胞组分(SDS电 泳分析)，发现对照组与5mMNTA处理组相比，其全菌可溶蛋白、全菌不可 溶蛋白、原生质体破碎蛋白、胞壁蛋白、原生质体不可溶蛋白、原生质体可溶 蛋白等成分均有差异。使用CAS检测法未能检测出海豚链球菌HD．1产生 源，而是另有途径。 I 在对缺铁胁迫培养条件下海豚链球菌的各种表观特征进行了初步研究后， 91 本研究利用海豚链球菌ATCC17菌株盲测序列数据库，与从NCBI中获得的 酿脓链球菌FtsABCD铁转运蛋白序列进行tblastn，找到同源性较高的海豚≯球 菌相关基因，并命名为海豚链球菌ftsABCD。设计特异性引物扩增基因全长后 发现jqsA基因全长783bp，编码260个氨基酸；fisB基因全长为927bp，编码 308个氨基酸；加C基因全长为1,029 bp，编码342个氨基酸；ftsD基因全长 为999 bp，编码332个氨基酸。经过生物信息学分析预测海豚链球菌FtsABCD 为一个ABC转运体(ABC 为底物结合蛋白，FtsC与FtsD均为通透酶。 通过克隆引入了BamHI、Xho I双酶切位点的ftsB成熟肽序列，构建了 原核表达质粒，然后将质粒转入大肠杆菌BL21进行FtsB重组蛋白的表达。通 过优化温度、时间与诱导剂IPTG浓度，最终确定了重组蛋白表达的最佳条 件。FtsB重组蛋白分子量为49．6kDa，由于其带有组氨酸标签，因此用镍柱对 混合蛋白进行纯化，然后对纯化的重组蛋白进行脱盐，冷冻干燥浓缩。 将海豚链球菌HD．1通过腹腔注射到小鼠体内，进行人工感染，在感染后 第10天取感染小鼠血清作为一抗，碱性磷酸酶标记的马抗鼠抗体为二抗，对电 转到硝酸纤维素膜上的FtsB重组蛋白进行westernblot检测。结果发现，一抗 能特异性的检测到FtsB重组蛋白。这表明海豚链球菌HD．1在感染小鼠的过程 中，ftsB基因转录并表达，且表达产物FtsB蛋白能被小鼠免疫系统识别为有效 抗原并产生了相应的抗体。因此，FtsB能够作为亚单位疫苗有效抗原的候选之 关键词：