A549细胞培养方法.doc

A549细胞的培养 A549细胞为人肺腺癌细胞，属于传代细胞系，可稳定地传代培养。一般用胰酶消化后，加入生长液稀释，以12~1:3传代培养都是可行的。 一[所需溶液] 1、细胞冲洗液：磷酸盐缓冲液PBS）——无Ca、MgNaCl 8.00 g； KC 0.20 g; KH2PO4 0.20 g; Na2HPO4·12H2O 1.15 g 加水至1000mL将H调至7.4，高压灭菌。 2、消化液 胰酶-PBS 结晶胰酶 2.5 g; 高压灭菌后的PBS 1000 ml 用磁力搅拌器搅拌均匀，使其完全溶解，通过0.22 μm的滤膜过滤除菌，分装备用，放置20℃保存。 胰酶—EDTA: 结晶胰酶 0.5 g; EDTA盐溶液 0.2 g 无Ca2+、Mg PBS 1000 ml 用磁力搅拌器搅拌均匀，使其完全溶解，通过0.22 μm的滤膜过滤除菌，分装备用，放置20℃保存。 3、细胞培养液：RPMI 1640培养液 配制方法： 将一袋干粉型RPMI 1640培养基溶于900 ml三蒸水中，冲洗包装袋两至三次倒入培养液中。 加入丙酮酸钠 0.1 g，NaHCO2 2 g以及双抗，加入磁力搅棒并置于磁力搅拌器上充分搅拌。双抗的配置浓度为 100 U/ 青霉素和100 U/链霉素。一般市售的青霉素为80 万U/瓶，将其溶解于4 ml三蒸水中，每升培养液中加入0.5 ml；市售的链霉素为100 万U/瓶，将其溶解于5 ml三蒸水中，每升培养液中加入0.5 ml。 调整培养液的值，用精密试纸观察即可。 过滤法除菌，所使用的滤器为加压过滤，μm滤膜，滤膜事先采用高压灭菌消毒。 分装，加盖瓶塞，加封纱布报纸，用绳固定，放置20℃保存。 二、［细胞的维持和培养］ 1、细胞的复苏 准备一个盛有℃温水的烧杯，从液氮罐中取出存有细胞的冻存管，放于℃温水中，用镊子夹住轻轻摇动使其迅速融化。 1000~2000 r，3min离心。 在无菌操作台中采用75%的乙醇彻底擦拭冻存管，然后打开冻存管，注意动作要轻柔。 用1 ml枪头将上清液去除，加入1 ml预热的细胞培养液将细胞吹散开，转移至25cm2培养瓶中。 补充4 ml的RPMI 1640培养基，并且添加10%的胎牛血清。 倒置显微镜下观察，37℃、5%CO2培养。 24h后，更换新的培养液。 常规传代培养。 A549细胞更换新的培养液 无菌操作打开培养瓶瓶盖，倒掉培养液。 用PBS反复冲洗细胞23遍。 加入新鲜的预热好的培养液及10%的胎牛血清。 各种液体需要量（ml） 表面积 25 cm2 75 cm2 150 cm2 洗涤 3 5 10 胰酶 12 1~3 2~5 培养液 5 10 20 倒置显微镜下观察，37℃、5%CO2培养。 3、A549细胞的传代 无菌操作打开培养瓶瓶盖，倒掉培养液。 向已经长满的细胞中加入消化液1 ml，轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有的细胞表面，吸弃或倒掉，轻轻冲洗细胞表面2遍，以尽可能去除原培养液中的牛血清。 加入1 ml消化液，在37℃培养箱中孵育5min后把培养瓶放置在倒置显微镜下观察，发现细胞的胞质回缩、胞间质增大后，立即终止消化。 加入5 ml预热至37℃的培养液，用玻璃吸管反复吹打以分散细胞。吹打过程按顺序进行，从培养瓶底部一边开始到另一边结束，以确保所有的底部都被吹到。 吸取一半的细胞悬液，接种到新的25 cm2培养瓶中，补足培养液，并且添加10%20%的胎牛血清。通常每瓶液体量为510 ml。 倒置显微镜下观察，37℃、5%CO2培养。 注意事项： 所有液体在加入细胞瓶前均应预热到37℃。所有液体均应调整H至7.2左右，均不能超过7.4。 细胞消化传代时吹打不要产生气泡，吹打力量不宜过多，否则会损伤细胞。 严格执行无菌操作的要求。 尽可能减少消化液剩余量，过多时会对细胞产生损伤，可多添加些含牛血清的培养液中和。 培养瓶在室温中放置时间应尽可能短。 4、A549细胞的冻存 消化已生长融合的单层细胞。 用生长液悬浮细胞，并且添加10%的FCS和10%DMSO二甲基亚砜。分装在2 ml容积的冻存管中。 用本实验室自制的冻存包包裹好冻存管，放在-70℃冰箱中过夜。 放入液氮中冻存。