蛋白质相互作用研究技术的新进展郭睿.docVIP

第 21 卷 6 期 天津医科大学学报 Vol． 21, No． 6 542 2015 年 11 月 Journal of Tianjin Medical University Nov． 2015 文章编号 1006－8147（2015）06-0542-03 综 述 蛋白质相互作用研究技术的新进展 郭 睿 综述，刘全忠 审校 （天津医科大学总医院皮肤性病科，天津 300052） 关键词 蛋白 相互作用；酵母双 交系 ；串 和 化；噬菌体展示；免疫共沉淀；GST-Pull down；Far-Western blotting； 光 共振能量 移；生物信息学 中图分类号 Q7 文献标志码 A  蛋白质相互作用网络基于蛋白质的生物学原理，它们之间的相互作用决定了分子与细胞水平上作用机制，从而起到调控机体健康和疾病状态的作用。此作用网络对于复杂的多基因疾病的靶向治疗领域的研究具有深远的意义[1]。本文着眼于酵母双杂交系统、串联亲和纯化、噬菌体展示、免疫共沉淀、GST-Pull down、Far-Western blotting、荧光共振能量转移、生物信息学等蛋白质相互作用研究方法，对其进行比较分析并进行综述。 生物化学与分子生物学研究技术 酵母双 交系 1.1.1 原理 Fields 和 Song[2]首次在研究真核基因 转录调控时建立该系统。其理论基础是基于 GAL4 转录激活因子的特性。GAL4 转录激活因子是一种由两个彼此分离但功能必需的结构域组合而成，即 DNA 结合结构域（DNA-BD） 和转录激活结构域（AD）。二者在临近位置相互作用时可重建功能性转录因子。在 MATCHMAKER 酵母双杂交系统（Y2H） 中，诱饵蛋白表达融合到 GAL4 的 DNA-BD，而猎物蛋白表达融合到 GAL4 DNA-AD。当诱饵和猎物蛋白相互作用时，DNA-BD 与 AD 形成功能性转录因子，导致酵母报告基因表达的激活，通过检测报告基因的表达产物可判断两种蛋白是否发生相互作用。此方法可以用来确定新的蛋白质的相互作用，分析两种已知蛋白的相互作用以及相互作用的蛋白质结构域分析[3-4]。 优缺点 酵母双杂交技术可以精确地分析已知蛋白间的相互作用，筛选编码未知蛋白的基 因，具有真实性、敏感性、高效性、广泛性等特性。其自身也存在缺点，如易产生假阳性、假阴性等[5]。 应用 You 等[6]将 wt-APP695 与 pBT3-SUC 诱饵载体相结合形成 pBT3-SUC-APP 复合物，利用 作者简介 郭睿(1991-)，男，博士在读，研究方向：皮肤性病学; 通信作者：刘全忠，E-mail: liuquanzhong@。  酵母双杂交筛选系统和免疫共沉淀技术，证实在阿尔茨海默症中，Staufen 1 蛋白（STAU1）可与淀粉样前体蛋白（APP）作用，由于 Stau1 属于双链 RNA 结 合蛋白家族，在哺乳动物系统介导 mRNA 的降解，因此推测淀粉样前体蛋白也可能参与 mRNA 调控。 串和化 1.2.1 原理 串联亲和纯化 理论基础[7]是一个利用两个亲和标签不同时序来纯化蛋白组件。TAP 标签蛋白由 Protein A、TEV 蛋白酶可剪切序列和钙调蛋白结合肽（CBP）组成[8]。在第一步纯化步骤中，TAP 标记的蛋白复合物通过第一个标签 Protein A 特异性结合到 IgG 琼脂珠。此 TAP 标签标记的蛋白质成分可被 TEV 蛋白酶裂解。清洗之后用洗脱液（含 TEV 蛋白酶）分离 Protein A 标签使含有靶蛋白的复合物释放。第二步亲和步骤，该蛋白质复合物通过第二个标签 CBP 固定于钙调蛋白琼脂珠。CBP-钙 调蛋白相互作用具有钙依赖性，而钙离子螯合剂用于第二步洗脱步骤来释放最后的蛋白复合物。此分离纯化的蛋白可通过串联质谱、免疫杂交等方法进行鉴定分析。TAP-MS 法已被证明在细菌、酵母和哺乳动物细胞以及多细胞生物如线虫、果蝇和老鼠的蛋白质相互作用研究中均有效[9]。 优缺点 TAP 技术假阳性和假阴性水平低，与质谱等其他技术联用可大规模地研究细胞内蛋 白质分子之间的相互作用网络。但 TAP 技术具有一定局限性：TAP 标签的引入可能会影响靶蛋白和亲和柱的结合；少数靶蛋白可能会在 TEV 蛋白酶处理 过程中被破坏；细胞裂解过程有时会影响 TAP 标签 表达[10]。 应用 Campden[11]应用 TAP 技术和质谱分析技术在胞核和细胞裂解物中来确定结合 Gβ1 亚基的候选蛋白，证实异三聚体蛋白 Gβγ 亚基调节细胞活性的作用。 1.3 噬菌体展示 噬菌体展示技术是将外源性 第 6 期 郭 睿，等. 蛋白质相互作用研究技术的新进展 543  （多）肽表达在噬