二代测序之建库步骤.pdfVIP

第一部分 DNA 酶处理：试剂为PROMEGA( RQ1 RNase-Free DNase ) 目的：失活DNase 酶 RNA （TE 洗脱） 8 微升 RQ1 RNase-Free DNase 10X Reaction Buffer 1 微升 RQ1 RNase-Free DNase 1 微升/微克RNA 合计 10 微升 37℃30 分钟孵育 加1 微升的 RQ1 DNase 终止液 65℃10 分钟使DNase 酶失活 （PS:经验 这一步最好在核酸提取之前就处理好，具体步骤如下：取样本 反复冻融三次，然后一万转离心十分钟，取上清，用 0.22 微米的滤膜过滤，加 DNase ，提核酸） 第二部分 RNA-seq system V2(cat.7102) 目的：生成并纯化cDNA 一、第一链合成 1. 融解第一链cDNA 合成试剂（蓝色盖）和无核酸酶的水（绿色） 2. 短时离心A3ver1 放在冰上，votex A1Ver4 和A2ver3 ，离心后放在冰上；无核 酸酶水放在室温； 3. 在冰上，取2ul A1 和5ul total RNA （500pg 到100ng）放在0.2mlPCR 管里； 4. 将PCR 管放在PCR 仪中运行程序1： RNA 量≤ 1ng 时，65℃2min ，4 ℃ 存放 RNA 量 1ng 时，65℃5min，4 ℃ 存放； 5. PCR 仪降到4 ℃后取出PCR 管放在冰上，加入制备好的第一链合成试剂，每 个样本加入3ul，混匀后，离心放在冰上： 第一链合成试剂：2.5ul buffer mixA2+ 0.5ul 酶混合液A3 （共3ul ） 注意：加酶A3 时要慢慢加入，反复吹打枪头至少5 次确保酶加入进去 6. 把加入第一链合成剂和样本的PCR 管放在PCR 仪上运行程序2 ： 4 ℃1min，25 ℃10min，42 ℃10min，70℃15min，4 ℃hold 二、第二链合成 1. 重悬RNAclean XP beads ，放在室温备用 2. 融解第二链合成试剂（黄盖） 3. 瞬时离心B2Ver2 ，放在冰上。，votex B1Ver3 ，离心后放在冰上； 4. 每个样本中加入 10ul 第二链合成混合液（9.7ul buffer mix B1+0.3ul B2 Enzyme mix ），轻轻混匀，放在冰上； 5. 把PCR 管放在PCR 仪上，运行程序3 ： 4 ℃1min，25 ℃10min，50℃30min，80℃20min ，4 ℃hold 6. PCR 仪降到4 ℃后取出PCR 管，放在冰上，进行cDNA 纯化。 三、纯化cDNA 1. 确定RNAclean XP beads 室温平衡，颠倒混匀（PS:需要提前取出室温平衡半 个小时以上，用之前需重新混匀并马上离心使用） 2. 在上述反应体系中加入beads32ul ，吹打混匀10 次； 3. 室温放置10min； 4. 把管放在磁力架上，放置5min，吸出45ul 结合buffer ，加入200ul 新鲜配制 的70%乙醇，放置30sec，用加样器吸出乙醇，重复洗涤3 次；最后洗涤后吸出 多余的乙醇，室温干燥 15-20min ，确保不案子完全干燥没有乙醇残留；继续进 行SPIA 扩增。 四、SPIA 扩增 1. 融解SPIA 扩增试剂（红色盖）； 2. 取C3ver7.5 颠倒混匀，瞬时离心后放在冰上，votex C1Ver9 和C2ver11，离 心后放在冰上； 3. 每个样本中加入SPIA master Mix40ul： 20ul buffer Mix C2 +10ul primer Mix C1+10ul Enzyme mix C3 ，与beads 充分混匀，放在冰上； 4. 把PCR 管放在PCR 仪上，运行程序4 4 ℃1min，47 ℃60min，80℃20min ，4 ℃hold 5. PCR 仪降到4 ℃后取出PCR 管，放在冰上，进行扩增产物SPIA cDNA 纯化或 者储存在-20 ℃。 五、纯化SPIAcDNA 用Qiagen minElute reaction cleanup kit 进行纯化。