蛋白折叠中间体和蛋白的错误折叠61 突变影响.pdfVIP

7.88 程笔记 - 11 7.24/7.88J/5.48J 蛋白质折叠 蛋白折叠中间体和蛋白的错误折叠 突变影响蛋白折叠中间体 蛋白错误折叠和中间体的形成 A. 蛋白折叠中间体和蛋白的错误折叠 周我们讨论了细胞色素c的再折叠，关于它的体外再折叠途径已经很清楚了。 考虑成功地进行再折叠的蛋白： 人们发现存在一个至关重要的中间体，它的结构比较奇怪，N和C末端的螺旋已经形成，但内部的折 叠还没有形成，或者说与天然的构象不同。 但如果你仔细地研究心肌蛋白的性质，细胞色素c并不能给你太多的信息。需要的 研究蛋白的再折 叠!! 你也许会发现，你克隆了心肌肌动蛋白的基因，并将其表达纯化。 用脲变性，透析使其再折叠，但我们无法获得可溶的肌动蛋白。 也许 纯化过程造成了某些轻微的损伤。在大肠杆菌中直接将编码序列克隆到表达载体 ，在体内高 水平的合成多肽链，但还 无法获得和肌动蛋白性质一样的可溶蛋白。 对于多少纯化的蛋白，可以尝试从完全变性的状态进行再折叠： 没有可以检测到的复性 – 当然通常这些都不会报道，仅仅成功的案例才会报道。如果序列本身 在体外足够驱动再折叠，那么根据已有的科学文献判断这 非常困 的，基本 不可能的。 o 肌动蛋白 o 微管蛋白 o T4 DNA聚合酶 o Rubisco –ribulose二磷酸脱羧酶 o 胶原质 产率低，且高度可变(从变性剂中稀释到缓冲液中) o -半乳糖苷酶 o Tryptophanase o 多亚基蛋白： -半乳糖苷酶，乳酸脱氢酶 B. 体外折叠是如何失败的，为什么会失败?? 这项工作 由法国Michel Goldberg、Charles Ghelis和Jeanine Yon的研究组进行了系统地研究(他们 关于这一领域的最好的教科书的作者)。 他们早期的一项观察发现： 如果通过透析的方法缓慢地去除变性剂，再折叠失败； 如果将变性剂快速地稀释很多倍，再折叠就会成功。 根据这些提出了一个两步走的实验方案 – 假定我们稀释脲分两步进行： 下面 -半乳糖苷酶在脲溶液中再折叠的数据。 将脲浓度从8M稀释到中等浓度； 保温1小时，然后 进一步稀释 4M时在少量重构的部分中产生了一定的狭长的槽。 保温时间越长，槽越深越宽。 F (处于中等脲浓度的时间) Also f(浓度) 在中等脲浓度 的蛋白浓度越高，槽越宽。对于tryptophanase在100/200/500 ug/ml时也获得了类似 的数据。 再折叠过程中，随着浓度的增加，复性产率下降。 Anfinsen起 对核糖核酸酶进行了研究，他发现了这一现象，但无法给出确定的解释。如果你了解核 糖核酸酶，那么你也可以简单地画出再折叠蛋白的产率和浓度像这样的关系。 这一现象解释如下： 在中等变性剂浓度下主要形成了折叠中间体 这些中间体不可逆地交联形成了无活性的聚集状态 关于折叠 {I} {I}{I} 模型：折叠支路 非特异的相互作用，没有非特异的相互作用。 Goldberg的实验： 因此：它事实 优化了单体蛋白再折叠的产率； 将变性剂快速稀释 尽可能地在最低的浓度下进行再折叠 C. 多聚体蛋白和浓度的选择 现在对于一个单体蛋白，聚沉要求碰撞，而折叠并不需要。 在尝试避免出现广泛存在的非天然的聚沉的过程中，人们发现通过简单地降低单体蛋白的浓度就可以 有效地抑制次级反应的发生。 在实验条件下，当研究单链蛋白时，这 一个切实可行的策略。然而 大量存在的蛋白的天然态不 多聚体，就 寡聚体。 在这种情况下，要想使溶液足够稀以避免链间的相互作用，从而再折叠以回到天然态几乎 不 可能的。 进一步考虑，在工业应用中，稀释 不实际的，或 在商业 行不通的，即便可行，还需要 下一步去浓缩。 对于多聚体蛋白，再折叠与浓度相关。 一个实际的方法：逐步稀释法再折叠，这样在任何一个时刻，部分折叠的中间体浓度始终保持最低。 中间体的性质不可能根据蛋白的天然结构来进行预测!! 如何来获得它们的性质呢？ D. 突变会