BRAF基因突变及甲状腺乳头状癌淋巴结转移相关性探究.docVIP

BRAF基因突变及甲状腺乳头状癌淋巴结转移相关性探究【摘要】 目的 探讨甲状腺乳头状癌（PTC）中BRAFV600E突变与淋巴结转移之间的相关性。方法 采用PCR直接测序法检测65例PTC患者肿瘤细胞DNA中BRAFV600E点突变，分析其与淋巴结转移的相关性。结果 BRAFV600E点突变在PTC中的发生率为61.5%（40/65）,其中40例BRAFV600E突变的PTC中有14例淋巴结转移，而未突变的25例患者中有淋巴结转移者10例，BRAFV600E点突变与淋巴结转移无相关性（?P?=0.7932）。结?论 ?BRAFV600E可能参与PTC的发生，但与PTC淋巴结转移无相关性。? 【关键词】 甲状腺乳头状癌； BRAF； 淋巴结转移 ?? 甲状腺癌是内分泌系统最常见的恶性肿瘤，其中PTC占甲状腺癌的85%~90%。PTC的发生发展涉及到多种基因的突变和重组，例如RET/PTC1, RET/PTC3的重排，NRAS突变和P53突变失活。2002年Davie等［1］报道在66%的恶性黑色素瘤和一系列其它肿瘤中检测到BRAF基因突变,该突变主要见于BRAF基因第11和15外显子的激酶结构域内,80% 以上的突变都是第15外显子位核苷酸上的单碱基颠换,致使其编码的氨基酸由缬氨酸转变为谷氨酸。随后在PTC中也检测到了BRAFV600E突变,突变率在28%～83% 之间 ［2~4］。近2年有报道称，BRAFV 600E突变的PTC更容易发生淋巴结转移，但两者之间的确切关系仍需要进一步的研究证明。因此，笔者检测了65例PTC中BRAFV600E突变的突变情况,旨在进一步探讨BRAFV600E突变和PTC淋巴结转移之间的关系。? 1 资料与方法? 1.1 一般资料 本研究收集了65例PTC患者的手术切除的新鲜组织，由有经验的病理学医生分辨瘤旁的正常组织和肿瘤组织，并立即保存于液氮中。所有病例均由2名以上病理学教授按照世界卫生组织分类标准进行形态学观察，并独立作出诊断。? 1.2 方法? 1.2.1 DNA 抽提 所有冰冻组织DNA均采用OMEGA DNA 抽提试剂盒提供的方法进行抽提，并采用nanodrop检测DNA的完整性和浓度，所有的DNA的OD值都大于1.9。? 1.2.2 引物合成 所需扩增引物均由上海生工生物工程有限公司合成，BRAF-F：ACCTAAACTCTTCATAATGCTTGCT，BRAF-R：CTGATTTTTGTGAATACTGGGAACT，扩增长度为318 bp。? 1.2.3 PCR反应 所用试剂均购于上海申能博彩生物科技有限公司。PCR反应体系为20 L终体积，内含双蒸水?13.4 L?， ?10×?PCR buffer（含Mg??2+?）2 L, dNT 200(mmol/L)0.4 L,上下游引物(10 pmol/L)各1 L, Taq 酶(5 u/L) 0.2 L, 模板2.0 L (约100 ng)。PCR反应条件：94 ℃ 5 min, 94 ℃ 30 s, 60 ℃ ?30 s?, 72 ℃ 30 s, 72 ℃ 10 min, 共35个循环。每一次实验都以双蒸水作为阴性对照。取PCR产物5 L，2%琼脂糖凝胶电泳, 溴化乙啶染色, 凝胶成像仪下观察并照相。? 1.2.4 PCR产物测序 将PCR 产物送往上海博尚生物技术有限公司纯化并测序，测序序列采用PCR前向引物，采用chromos软件进行序列读取，并将测序结果经BLAST基因服务网站进行比对，以确定有无突变。? 1.3 统计学处理 采用SPSS 10.0软件, 组间比较用?χ??2 检验。? 2 结果? 本次研究收集了65例PTC患者，其中40例患者的肿瘤组织含有BRAFV600E突变（图1），突变率为61.2%，而瘤旁的正常组织均无此突变。40例含有BRAFV600E点突变的患者有14例(35%)发生了淋巴结转移，25例未含有该突变的患者有10例(40%)发生了淋巴结转移，该相关性差异无统计学意义（?P?=0.7932）（表1）。? 3 讨论? 不同的研究报导中BRAFV600E在PTC中的突变率不尽相同，从28％～83％不等，主要与不同地域及民族背景等流行病学因素有关。此外，有学者认为可能与PTC的亚型分布有关，经典型PTC、滤泡亚型PTC和甲状腺滤泡状癌（FTC）组织的BRAF V600E突变率分别为51％、24.1％和1.4％。本实验共收集65例PTC患者，突变率为61.5%。Sitham andam［5］和Mercer等［6］证实，BRAF基因为MAPK通路中最强的活化因子,将BRAF突变体转染到NIH3T3细胞内,其转化效率比野生型B