反义结缔组织生长因子对人瘢痕疙瘩成纤维细胞作用.doc

反义结缔组织生长因子对人瘢痕疙瘩成纤维细胞作用[摘要]目的： 研究结缔组织生长因子(CTGF)反义寡核苷酸(ASODN)对人瘢痕疙瘩成纤维细胞CTGFmRNA的表达和细胞增殖及胶原合成的影响，探讨瘢痕疙瘩的基因治疗。方法：体外分离、培养人正常皮肤成纤维细胞(NSF)和瘢痕疙瘩成纤维细胞(KF)，以脂质体介导方法将CTGFASODN转染KF中，用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法检测细胞中CTGFmRNA的表达；采用MTT方法测细胞增殖；3H-脯氨酸掺入法检测细胞的胶原合成量。 结果：CTGFmRNA在NSF中几乎无表达，在KF中表达增高，CTGFASODN可以抑制其增殖和胶原合成(P 1.6逆转录-聚合酶链式反应：于转染后48h按照TRIzol说明书在培养瓶中提取总RNA，1%甲醛琼脂糖变性凝胶电泳检测RNA样本的完整性良好，并用RNA/DNA计算器检测RNA的浓度。取RNA2.0μg作逆转录，反应条件为70℃10min,37℃60min，99℃5min.取1μl逆转录产物为模板，三磷酸甘油醛脱氢酶(G3PDH)为外参照，将CTGF与G3PDH同等条件扩增。预期CTGF的扩增片段长度微766bp，上游引物为5，-GCCCAGACCCAACTATGA-3，下游引物为5，-ACCCTCCCAC TGCTCCTA-3，；G3PDH的扩增片段长度为450bp，上游引物为5，-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3，下游引物为5，-TCCACCACCCTG TTGCTGTA-3，。反应条件为：94℃预变3min、94℃变性40s、56℃退火 40s、72℃延伸40s，共循环30次,72℃延伸10min。取PCR产物5μl在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，用凝胶成像系统观察结果并照相，用计算机图象处理系统分析，计算目的基因、G3PDH基因条带相对吸光度。 1.7MTT法测成纤维细胞增殖每孔5×103个细胞接种于96孔培养板上，每组做三孔，取平均值。分别于转染6、12、24、48、72h取出一块培养板，用MTT法测定各孔光吸收值，以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生长曲线。 1.83H-脯氨酸掺入法测成纤维细胞胶原蛋白合成：瘢痕疙瘩成纤维细胞1×104个/孔分种于24孔培养板上，于转染48h后吸弃上清液，加入3H-脯氨酸继续培养10h，多孔收集器收集细胞于玻璃纤维纸上，液闪测定仪闪烁记数测定3H-脯氨酸掺入量。每组设3个复孔。 1.9统计学分析：采用SPSS 10.0统计软件包，对各实验组数据进行单因素方差分析。 2实验结果 2.1 逆转录-聚合酶链式反应结果：CTGFmRNA在NSF组中表达极弱，在KF中表达增强，ASODN组CTGFmRNA表达减弱(图1)。CTGFmRNA的表达量经方差分析，CTGF ASODN组表达量（0.28±0.62）显著低于KF组（0.74±0.16），差异有显著性意义（P [5]Hishikawa K,Oemar BS,Nakaki T.Static pressure regulates connective tissue growth factor expression in human mesangial cells[J]. J Biol Chem, 2001,276(20):16797-16803. [6]Chen MM, Lam A, Vidaud M, et al. CTGF expression is induced by TGF-β1in cardiac fibroblasts and cardiac myocytes: a potential role in heart fibrosis[J]. J Mol Cell Cardiol,2000,32(10):1805-1819. [7]Grotendorst GR,Okochi H,Hagash N,et al. Role of connective tissue growth factor in fibronectin expression and tubulointerstitial fibrosis[J].Am J Physiol Renal Physiol,2002,282(5):933-942. [8]郝立君,李宜姝,段国新,等. 抗转化生长因子β1预防和治疗瘢痕疙瘩的研究[J].实用美容整形外科杂志,2003,14(5):271-274. [9]Colwell AS,Phan TT,Kong W,et al. Hypertrophic scar fibroblasts have increased connective tis