质粒提取、定量及酶切鉴定.pptVIP

质粒DNA的提取、定量与酶切鉴定;实验流程图; 掌握碱裂解法提取质粒的方法 掌握紫外吸收测定DNA的方法 了解质粒酶切鉴定原理 掌握琼脂糖凝胶电泳技术;实验材料;实验仪器;;独立于细菌染色体以外，能独立自主复制的闭合环状DNA分子 基因工程常采用的载体;碱裂解法； 煮沸裂解； 羟基磷灰石柱层析法； 质粒DNA释放法； 酸酚法等;碱裂解法基本原理;pMD18-T;溶液S1（细菌悬浮液） 裂解液S2 中和液S3 洗涤液W 洗脱液 RNase A(100mg/ml) DNA吸附柱;1, 取1.5ml培养物加入Eppendorf管中，室温离心12000rpm×1min，弃上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。 2, 加入250μl 溶液S1中，旋涡振荡，使细菌沉淀分散，彻底悬浮。 3, 加入250μl 裂解液S2，颠倒4～6次混匀（不要剧烈振荡），室温静置3min（不超过5min）。 4, 加入350μl 中和液S3，立即温和颠倒6~8次混匀，至出现白色絮状沉淀。 5，室温12000rpm离心10min。 6, 分次小心取上清液转至吸附柱中（带收集管），每次600μl，室温12000rpm离心30s，弃滤液，将吸附柱重新放回收集管中。 7, 向吸附柱中加入600μl 洗涤液W， 12000rpm离心30s ，弃滤液。 8, 重复步骤7一次。 9, 空柱10000rpm离心2min。 10,取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间加50μl 56 ℃预热的洗脱液，室温放置1min，12000rpm离心1min，收集洗脱液（即纯化的质粒DNA）， -20℃保存备用。 ;实验流程;;二、质粒DNA定量测定;操作步骤;DNA或RNA的定量 A260=1.0相当于 50μg/ml双链DNA 40μg/ml单链DNA（或RNA） 20μg/ml寡核苷酸;DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8 RNA纯品: OD260/OD280 = 2.0;三、质粒DNA的酶切分析;限制酶特异性地结合于一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA序列之内或其附近的特异位点上，并在此切割双链DNA。 分子克隆中常用的为II型限制酶，其识别位点长度为4～6个核苷酸的反向重复序列。;EcoRⅠ和HindⅢ的识别序列和切口是： ? EcoRⅠ：G↓AATTC ? HindⅢ：A↓AGCTT ;pMD18-T;反应物 ;影响酶切反应的因素;四、琼脂糖凝胶电泳;电泳：带电粒子在电场中泳动的现象;琼脂糖凝胶;胶浓度（％）;琼脂糖凝胶的制备 上样：加样前，样品先与6×上样缓冲液混匀 电泳 ：电压100v；30min 结果观察：凝胶成像仪　 ;琼脂糖凝胶电泳;刺磅泰主寨捉扭息盎克卵巍匝裴饲批虑栈士辖勤镑泊古庸村按蒂獭妆偶挂质粒提取、定量及酶切鉴定质粒提取、定量及酶切鉴定;向电泳槽中加入0.5×TBE电泳缓冲液，越过凝胶表面即可； 轻轻拔出固定在凝胶中的梳子； 样品准备：向核酸样品中加入约为样品体积1/6的上样缓冲液，用加样器轻轻混匀； 上样：用加样器吸取样品，轻轻的加入到凝胶的样品孔中，加样量为6 μl ； 盖上电泳槽，接通电源，开始电泳； 电泳条件：电压80v；时间25～30分钟； 电泳结束后，切断电源，取出凝胶。 电泳结果分析：紫外检测仪直接观察电泳条带 13. 取出凝胶，置于凝胶成像仪中观察结果，并拍照记录。;琼脂糖凝胶电泳上样;DNA Marker (ladder) 　;Loading Buffer上样缓冲液;染色 溴化乙锭(Ethidium　Bromide，EB) :3,8-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶溴盐，能插入DNA分子碱基对之间并与之结合,在紫外光照射下呈现红橙荧光, 优点：染色操作简便，快速；灵敏度高 缺点：有致癌性(使用时一定要戴手套);共施年窟汕诺高炽映娄铸剔酚劳园滨耸涡氯整比递翠沃弥喜布栏隆札决挝质粒提取、定量及酶切鉴定质粒提取、定量及酶切鉴定;1 2