基质金属蛋白酶-7在鼻咽癌中表达及及肿瘤侵袭转移关系.docVIP

基质金属蛋白酶-7在鼻咽癌中表达及及肿瘤侵袭转移关系摘 要 目的：观察基质金属蛋白酶-7(MMP-7)蛋白在鼻咽癌中的表达及与肿瘤侵袭转移的关系。方法：采用成组设计的对照试验方法，运用免疫组化及逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术，检测MMP-7蛋白及mRNA在鼻咽癌及慢性鼻咽炎组织中的表达。使用方差分析、q检验、t检验和X2检验进行组间差异的统计学分析。结果：MMP-7蛋白在鼻咽癌中的阳性表达率为79.17%，明显高于在慢性鼻咽炎中的表达率11.11%(P＜0.001)；MMP-7 mRNA在鼻咽癌中的阳性表达率为89.58%，表达量为0.467±0.199，显著高于在慢性鼻咽炎组织中的表达率16.67%(P＜0.001)；MMP-7蛋白及mRNA的表达与鼻咽癌患者的性别、年龄无关，与鼻咽癌的T分期、N分期及临床分期密切相关(P＜0.05)。结论：MMP-7在鼻咽癌中阳性表达率高，其表达随着肿瘤浸润深度、区域淋巴结转移范围和临床分期的增加而增强，与鼻咽癌侵袭及转移密切相关。 关键词 鼻咽癌 肿瘤侵袭与转移 基质蛋白酶-7 鼻咽癌(NPC)是我国常见的头颈部恶性肿瘤，尤以中南各省高发，俗称为“广东瘤”。由于鼻咽癌是一种低分化、高转移性恶性肿瘤，其治疗失败的主要原因仍然为局部区域性复发与远处转移，因而侵袭和转移仍是导致鼻咽癌患者死亡的主要原因［1］。基质金属蛋白酶-7(MMP-7)作为MMP家族中较为重要的基质降解素，已经发现其表达与消化道等恶性肿瘤的浸润与转移相关。我们检测了MMP-7蛋白在鼻咽癌中表达水平，并探讨其表达与肿瘤侵袭转移的关系，旨在发现有预示作用的生物分子指标。现将实验结果报告如下。 资料与方法 随机选取2005年5月～2005年9月广东医学院附属医院耳鼻咽喉-头颈外科就诊的鼻咽癌病例48例。采用卫生部组织编写的《鼻咽癌诊治标准》第5版为病理组织学分型标准［2］，全国鼻咽癌分期专题研讨会(福州，1992年)推荐的临床分期方法为临床分期标准［3］。纳入标准：①根据临床表现初步判定为鼻咽癌；②鼻咽原发癌组织活检病理确诊为鼻咽癌；③均行鼻咽部CT扫描明确肿瘤病灶范围；④所有病例均为初诊患者，未行放疗或化疗治疗。48例鼻咽癌病例中，男34例，女14例，年龄47.63±13.58；临床分期情况：Ⅰ期4例，Ⅱ期19例，Ⅲ期15例，Ⅳ期10例，其中T1 9例，T2 15例，T3 14例，T4 10例，N0 14例，N1 21例，N2 12例，N3 1例。经病理组织学检查，48例鼻咽癌均为低分化鳞状细胞癌。选取同期就诊行鼻咽部活检，并最终病理诊断为慢性黏膜炎症的慢性鼻咽炎病例18例，作为对照组。 试剂与方法：①试剂采用SP-9000通用试剂盒、鼠抗人MMP-7单克隆抗体。RNA抽提试剂Trizol，一步法RT-PCR试剂盒，PCR引物(序列见表1)。②标本制备：于鼻内镜直视下钳取鼻咽部病变组织，将所取标本一部分置于中性福尔马林液中固定，经脱水、透明、浸蜡后石蜡包埋保存，备用于免疫组化实验。另取一部分标本保存于-70℃低温冰箱中(所取标本质量≥300mg，并于取材后10分钟内置于低温冰箱内)，以备用于RT-PCR实验。实验物品去核糖核酸酶(RNase)处理。③免疫组化染色检测方法：手术切除标本用10%甲醛固定，经脱水、透明、浸蜡后石蜡包埋保存。实验前制成厚4μm连续石蜡切片，采用免疫组化SP法进行切片染色，染色步骤按照试剂盒及一抗说明书要求进行。用PBS液代替一抗作为阴性对照。结果由两位观察者采取盲法进行读片。把制好的切片放于显微镜下观察，正常组织取黏膜上3个高倍区域(×200)，癌组织选取癌细胞丰富的3个高倍区域(×200)。MMP-7在正常组织中一般不表达，在肿瘤细胞组织中可见细胞浆内棕黄染色，根据计算法［4］评定MMP-7阳性结果。④RT-PCR检测方法：a.抽提RNA：采用Trizol一步法抽提RNA，经紫外分光光度计验证后调整RNA浓度为1g/L后作RT-PCR反应。b.一步法RT-PCR反应：RT-PCR反应体系包括10×One Step RNA PCR Buffer 5μl、MgCl2 (25mM) 10μl、dNTP Mixture (10 mM) 5μl、RNase Inhibitor (40 U/μl) 1μl、AMV RTase XL (5 U/μl) 1μl、AMV-Ptimized Taq (5 U/μl) 1μl、上下游特异性引物 (20 μM)各1μl、实验样品(1μg Total RNA) 1μl、RNase Free dH2O 24μl。反应条件为50℃ 30分钟、94℃ 2 分钟、94℃ 30秒、52℃(为MMP-7的退火温度，GAPDH的退火温度分别为55℃)