大鼠肾缺血-再灌注后p38MAPK蛋白表达变化及银杏达莫注射液对其影响.docVIP

大鼠肾缺血-再灌注后p38MAPK蛋白表达变化及银杏达莫注射液对其影响摘 要：目的：探讨银杏达莫注射液对肾缺血-再灌注损伤的保护作用及机制。方法：肾缺血1h再灌注1h建立大鼠肾缺血再灌注损伤模型，用银杏达莫注射液分别按剂量0.9、1.8、3.6mL/kg预处理7天。通过检测肾组织丙二醛含量、超氧化物歧化酶的活性及血肌酐、血尿素氮的含量。电镜下观察各组肾组织的形态学变化，Western印迹法观察p38 MAPK蛋白的活化情况。结果：缺血再灌注损伤后，肾组织出现明显病理改变，肾组织丙二醛含量升高，超氧化物歧化酶活性下降，血肌酐、尿素氮水平升高，肾组织p- p38MAPK蛋白水平显著上升。银杏达莫注射液预处理能降低血肌酐、尿素氮水平及肾组织丙二醛含量，增强超氧化物歧化酶活性和下调p- p38MAPK蛋白水平，与模型组比较有显著性差异（P 肾脏对缺血-再灌注损伤（ischemia reperfusion injury）极为敏感。肾移植、严重创伤休克后延迟复苏均会导致不同程度的肾脏IRI【sup】［1-2］【/sup】，肾缺血-再灌注损伤（renal ischemia-reperfusion injury，RIRI）是发生急性肾衰竭及影响移植存活的重要因素，机制十分复杂。如何采取简便、有效的措施防止因肾脏IRI而导致的各种急慢性肾脏疾病，一直是国内外学者关注的重点、难点和热点。 近年来，有关器官缺血再灌注后细胞内信号通路的变化日益受到重视。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）是细胞内重要的信号转导系统之一。MAPK家族由3个主要的亚族组成：ERK、JNK/SAPK和p38MAPK。ERKs主要作为细胞促有丝分裂增殖/分化的活化因子；JNK/SAPK和p38MAPK则主要参与细胞凋亡相关蛋白的应激活化【sup】［3］【/sup】。其中p38MAPK主要参与介导应激反应，细胞外多种应激原如放射线、紫外光、热休克、高渗液、促炎因子（如TNF-α,IL-1）等都可激活p38MAPK通路【sup】［4］【/sup】，活化后的p38MAPK以转位的方式进入细胞核，激活其下游的底物，影响细胞的增殖、分化、转化、凋亡等生物效应【sup】［5］【/sup】。银杏达莫注射液（Ginkgo biloba extract and Dipyridamole injection，XGD）是以银杏叶提取物（EGB）为基础的复合制剂，目前已在心脑血管疾病及糖尿病防治中发挥了重要的作用，但在防治RIRI方面的研究尚不多，值得进一步进行实验研究。本实验利用大鼠RIRI模型，观察银杏达莫注射对RIRI的保护作用及其对p38MAPK通路的影响，为临床应用银杏达莫注射液防治RIRI提供理论依据。 1 材料与方法 1.1 动物及试剂 健康雄性Sprague-Dawley大鼠（清洁级），体重200±20g，购自温州医学院实验动物中心，许可证号：SCXK（浙）2005-0019；银杏达莫注射液（山西普德药业有限公司生产，批号，由乐清市人民医院提供；超氧化物歧化酶（SOD）?丙二醛（MDA）?尿素氮（BUN）?肌酐（Cr）检测试剂盒及蛋白定量试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。Trizol试剂购自美国Invitrogen公司，逆转录试剂盒购自美国MBI公司。 1.2 仪 器 722N分光光度计（上海精密科学仪器有限公司），聚合酶链式反应DNA扩增仪（美国Bio-Rad公司），凝胶定量软件Quantity One（Bio-Rad公司），Image-pro plus 5.0彩色图像分析系统（美国Media Cybernetics公司），EXL-808酶标仪（美国Bio TeK公司）。 1.3 实验动物分组及方法 50只SD大鼠随机分为3组，每组10只。（1）对照组：按1.8mL/kg体重尾静脉注射生理盐水，每天1次，连续7天；（2）模型组：按1.8mL/kg体重尾静脉注射生理盐水，每天1次，连续7天；（2）银杏达莫注射液处理（高、中、低）组：按0.9、1.8、3.6mL/kg体重尾静脉注射XGD每天1次，连续7天。动物用药量是根据银杏达莫注射液的临床用药，利用大鼠与人的等效剂量换算方法计算得来。 1.4 标本收集 第8天每组大鼠经3%戊巴比妥钠40mg/kg腹腔注射麻醉，麻醉成功后，仰卧位固定，作腹部正中3～4cm切口，分离肾周组织，暴露双侧肾脏，游离右侧肾脏结扎肾蒂并摘除右肾。假手术组不做其他特殊处理，模型组和药物处理组先用微动脉夹夹闭左肾蒂缺血1h，然后移去动脉夹再灌注1h建立缺血再灌注损伤模型。全部大鼠都经下腔静脉取血，血液标本用4000r/min高速离心机离心10min，留取上清液进行血肌酐（serum cre