发光细菌法急性毒性试验课件.PPT

主要内容 * 发光细菌法急性毒性的测定 四、实验材料与方法 三、实验原理 二、实验目的与内容 一、 简 介 五、实验步骤 六、注意事项 七、习题与思考 1978年美国 Beckman 公司即推出功能完备的生物发光光度计“Microtox”，自此，这一急性毒性测试技术在世界范围内迅速推广。因此人们也将发光菌毒性测试称为Microtox测试。 简 介 发光菌毒性测试是20世纪70年代后兴起的一种微生物监测环境污染及检测污染物毒性的新方法。 采用现代光电检测手段(生物发光光度计)的发光菌生物毒性实验是毒理学中生物测定的方法之一。 该方法快速、简便、灵敏、廉价,在有毒物质的筛选，环境污染生物学评价等方面有重要的意义，因而备受各国有关研究者的关注。 1995年3月，国家环境保护局、国家技术监督局将发光菌毒性测试定为水质监测标准方法(GB/T 15441-1995)。 简 介 实验目的与内容 一、实验目的 1. 掌握发光细菌毒性测试的标准方法； 2. 根据发光细菌发光强度的变化判断 受试化合物的毒性； 3. 初步了解发光细菌毒性测试的影响因素。 二、实验内容 1. 发光细菌的复苏； 2. 发光细菌发光强度的测定； 3. 受试化合物毒性的计算。 实验目的与内容 发光细菌是一种非致病性的普通细菌，具有发光能力，在正常条件下经培养后能发出肉眼可见的兰绿色光，这种发光过程是细菌体内一种新陈代谢反应，是氧化呼吸链上的一个侧支。发光细菌的发光反应模式图(1)所示。发光细菌发光反应途径可简单概述为： FMNH2＋O2＋RCHO→荧光＋FMN＋H2O+RCOOH （1） 这个发光现象是呼吸代谢耦合，作为光能被散发。当细菌体内合成萤光酶、萤光素、长链脂肪醛时，在氧的参与下发生生化反应，反应的结果便产生光。 发光菌的发光现象是其正常的代谢活动, 在一定条件下发光强度是恒定的, 与外来受试物(无机、有机毒物, 抑菌、杀菌物等) 接触后, 其发光强度即有所改变。变化的大小与受试物的浓度呈相关关系, 同时与该物质的毒性大小有关。通常认为外来受试物通过下面两个途径抑制细菌发光: (1) 直接抑制参与发光反应的酶类活性; (2) 抑制细胞内与发光反应有关的代谢过程(如细胞呼吸等)。 毒物的毒性可以用EC50表示, 即发光菌发光强度降低50% 时毒物的浓度。实验结果显示, 毒物浓度与菌体发光强度呈线性负相关关系。因而可以根据发光菌发光强度判断毒物毒性大小, 用发光强度表征毒物所在环境的急性毒性。 实验原理 图 (1) 发光细菌的发光反应模式。E1: 细菌荧光素酶，由α、β 2个亚基组成，α为40000~42000D，β为37000~39000D。单独α、β亚基均无发光活性，只有α、β共存时才有活性。E2: NADH：FMN氧化还原酶，分子量为3000D，对FMN有高度特异性。E3: 脂肪酸还原酶。 实验材料与方法 1. 试剂：氯化汞（分析纯）；氯化钠（化学纯）；蒸馏水。 氯化钠溶液，2.0 g/100 ml (3.0 g/100 ml)，称取2.0 g (3.0 g)氯化钠溶于100ml蒸馏水中，置于2-5℃冰箱备用。 氯化汞母液，2 000 mg/L，万分之一分析天平精称密封保存良好的无结晶水氯化汞0.1000 g于50 ml容量瓶中，用3.0 g/100ml氯化钠溶液稀释至刻度，置于2-5℃冰箱备用，保存期6个月。 氯化汞工作液，2.0 mg/L，用移液管吸取氯化汞母液10 ml入1000 ml容量瓶，用3.0 g/100ml氯化钠溶液定容。再用移液管吸取氯化汞20 mg/L 液25 ml入250 ml容量瓶，用3.0 g/100 ml氯化钠溶液定容，将此液倒入配有半微量滴定管的试液瓶，然后，用3.0 g/100 ml氯化钠溶液将氯化汞2.0 mg/L溶液按表1稀释成系列浓度(稀释至50 ml容量瓶中)。配制的稀释液保存期不超过24小时。 0.24 0.22 0.20 0.18 0.16 0.14 0.12 0.10 0.08 0.06 0.04 0.02 配制氯化汞浓度，mg/L 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 氯化汞工作液体积，ml 表1 氯化汞工作液稀释配制系列(稀释至50 ml容量瓶中) 2. 明亮发光杆菌T3小种 (Photobacterium phosphoreum T3 spp.)冻干粉，安培瓶包装，在2-5℃冰箱内有效保存期为6个月。新制备的发光细菌休眠细胞(冻干粉)密度不低于每克800万个细胞；冻干粉复苏2 min