塞来昔布对人淋巴瘤细胞株Raji增殖、凋亡及存活素表达的影响.docVIP

　　塞来昔布对人淋巴瘤细胞株Raji增殖、凋亡及存活素表达的影响 ：范红 程远东 孙哲 吕晓东 【摘要】 目的 观察选择性COX2抑制剂塞米昔布(Celecoxib)对Raji细胞增殖、凋亡及细胞周期分布的影响，并检测存活素(Survivin)在细胞中的表达情况。方法 应用流式细胞术(FCM)分析Celecoxib对人Burkitt淋巴瘤Raji细胞周期的影响并检测细胞凋亡及存活素在细胞中的表达情况，应用RTPCR法检测细胞中Survivin mRNA的表达水平。结果 Celecoxib各浓度组作用于Raji细胞24、48、72 h后吸光度值与对照组相比均有显著性差异(Plt;0.05)，同时各浓度组之间以及时间组之间有显著性差异(Plt;0.05)。Celecoxib各浓度组作用于Raji细胞48 h后各浓度组间Celecoxib对细胞凋亡率和细胞周期的影响、下调Survivin蛋白表达下调Survivin mRNA相对表达量具有显著性差异(Plt;0.05)。结论 Celecoxib能够通过诱导凋亡抑制Raji细胞的增殖，其机制可能与抑制Survivin表达有关。 【关键词】 Celecoxib;淋巴瘤;细胞周期;凋亡;Survivin 　选择性COX2抑制剂塞来昔布(Celecoxib)是近年来用于临床的新型非甾体类抗炎药，其药理作用特点是选择性作用于COX2，能使许多肿瘤细胞的增殖受到抑制，但具体机制仍未完全清楚。Survivin作为一种多肿瘤抑制基因在肿瘤细胞的凋亡过程中起调控作用。目前国内外有关Survivin表达与Celecoxib诱导淋巴瘤细胞凋亡之间关系的研究尚处于空白。本实验通过体外培养人Burkitt′s淋巴瘤Raji细胞，观察选择性COX2抑制剂Celecoxib对Raji细胞生长增殖、凋亡及细胞周期分布的影响，并检测凋亡抑制因子Survivin在细胞中的表达情况。 　 　1 材料与方法 　　1.1 材料 Burkitt′s淋巴瘤细胞株Raji由郑州大学基础医学院提供，常规培养于含10%的灭活胎牛血清(FBS)的RPMI1640培养基中，置于37℃，5% CO2饱和湿度培养箱内培养，2～3 d传代1次。台盼蓝排斥实验检测细胞拒染率均在95%以上。实验分为对照组:细胞培养基中加入与实验组等体积的DMSO。(预实验显示终浓度0.1%的DMSO在实验中对Raji细胞生长没有明显影响);实验组:细胞培养基中加入DMSO溶解的Celecoxib(南京德宝生化器材有限公司)，终浓度分别为12.5、50、100、150 μmol/L〔1〕。 　　1.2 MTT法检测Celecoxib对Raji细胞生长的抑制作用 取对数生长期的Raji细胞，调节细胞浓度为1×105/ml,接种于24孔细胞培养板中，每孔100 μl(1×104个细胞/孔)，分别加入处理因素，同时设对照组，每组均设3个复孔。实验重复3次。细胞孵育24、48、72 h,孵育结束前4 h，各培养孔加入MTT(Merke公司)(5 mg/ml)10 μl,1 500 r/min离心10 min,弃上清，每孔加入DMSO 100 μl。 震荡15 min溶解结晶，全自动酶标仪测出每孔吸光度值(A492值)， 计算 细胞抑制率。 　　1.3 流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡率和周期分布 取对数生长期的Raji细胞，调节细胞浓度为1×106/ml,接种于24孔细胞培养板中，每孔1 ml(1×106个细胞吼)，分别加入处理因素，同时设对照组，每组均设3个复孔。实验重复3次。细胞孵育48 h后离心收集细胞，并用70%乙醇固定，4℃过夜后再经PBS洗2次，加入碘化丙啶(PI)1 ml,4℃避光30 min，用Beckman Coulter公司提供的流式细胞仪标准程序进行分析。 　　1.4 FCM检测Raji细胞中Survivin蛋白表达 收集细胞，去除样品中的70%乙醇，用PBS离心洗涤2次，加入Survivin鼠抗人单克隆抗体一抗(Santa公司)工作液100 μl,工作浓度1∶100(克隆系FL142)。室温孵育30 min，PBS10 ml洗涤1次，弃上清。加入羊抗鼠FITCIgG二抗工作液100 μl,室温孵育30 min，PBS 10 ml离心同上，弃上清，加入PBS 0.1 ml经500目铜网过滤后上流式细胞仪检测。 　　1.5 RTPCR法检测Raji细胞中Survivin基因表达水平 　　1.5.1 细胞总RNA提取:Trizol试剂盒提取RNA。 　　1.5.2 RTPCR (1)引物设计:Survivin、βactin引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。Survivin:上游引物5′GCATGGGTGCCC