凤丹内生菌的分离鉴定及抑菌活性研究.docVIP

凤丹内生菌的分离鉴定及抑菌活性研究 　　[关键词]凤丹：内生菌：分离：鉴定：抑菌性 　　内生菌（endophyte）广泛存在于植物各器官、组织的细胞内及细胞间隙，具有丰富的宿主植物种类多样性、在宿主植物组织中分布多样性以及功能多样性的特点，国内外相关研究报道很多，但未见道地药材基原凤丹的内生菌研究报道。鉴于植物内生菌种类很大程度上受制于植物本身的生理特点和周边的环境，而中药材又历来重视道地性，本研究对凤丹根部内生菌进行分离、鉴定和抑菌实验研究，在为生产实践服务的同时也为道地药材凤丹的研究积累科学资料 　　1材料与方法 　　1.1供试样品 　　2012年7―10月，在凤丹的果期和地上部分渐枯期，选择安徽铜陵顺安正常生长的三年生植株，参考平行线取样法，开挖30～40 cm的土壤剖面，去除表层土后收集根样：采集的根样用锡箔纸包裹好带回实验室置放4℃冰箱备用。 　　按常规方法准备牛肉膏蛋白胨固体培养基（NA）、马铃薯葡萄糖固体培养基（PDA）；液体发酵培养基为上述培养基不加琼脂 　　1.2内生菌分离与纯化 　　取凤丹根样洗净，晾干并进行表面消毒.取200 μL最后一次冲洗液涂布至相应平板中，检测表面消毒效果 　　在无菌状态下将处理完毕后的凤丹根样品切成0.2 cm×0.2 cm长段（片）置于PDA培养基、28℃下静置培养5～10d，挑取植物组织周围的菌落转接入PDA斜面中并纯化；同时，将上述根样置于NA培养基、37℃下静置培养48 h，培养基中可见菌落形成时挑取植物组织周围的菌落转接入牛肉膏培养基斜面中并纯化。 　　1.4抑菌试验 　　供试菌株金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌、毛霉、黑线炭疽菌、青霉、西瓜枯萎病原菌、链格孢霉菌，由安徽师范大学生命科学学院微生物研究室提供。 　　2结果与分析 　　2.1凤丹内生菌的种类构成 　　2.1.1内生真菌 结合形态学鉴定结果（表1），将内生真菌ITS序列在NCBI网站上用BLAST软件进行序列比对并利用MEGA 5.05采用Neighbor-Join-ing法构建凤丹内生真菌系统发育树（图1）。 　　2.1.2内生细菌 结合生理生化鉴定结果（表2），将内生细菌16SrDNA序列在NCBI网站上用BLAST软件进行序列比对并利用MEGA 5.05采用Neigh-bor-Joining法构建凤丹内生细菌系统发育树（图2）。 　　2.1.3不同生长时期内生菌分布及其多样性 实验共分离得到内生菌129株：内生真菌58株，其中果期的内生真菌35株、分离率为27.1%，地上部分渐枯期的内生真菌23株、分离率为17.8%：内生细菌71株，其中果期的内生细菌42株、分离率为32.6%，地上部分渐枯期的内生细菌29株、分离率为22.5%。果期与地上邵分渐枯期根样中内生菌种类和数量基本一致（表3）。 　　结合形态特征、ITS序列分析和系统发育分析，所得58株凤丹内生真菌隶属4属、6种：革菌属Thanatephorus 1种、青霉属Penicillum 1种、镰刀菌属Fusarium 3种、赤霉属Gibberella 1种，优势属镰刀菌属Fusarium，共有45株，占到77.6%，而镰刀菌属中的F.oxvsporum与F.purpurogenum为凤丹的优势真菌，分别占分离内生真菌总菌株的44.9%，24.1%。 　　结合内生细菌生理生化鉴定结果、16S rDNA序列分析和系统发育分析，所得内生细菌71株隶属3属9种，其中芽孢杆菌属Bacillus 6种、土壤杆菌属Agrobacterium 1种、假单胞杆菌Pseudomonas属2种。58株9种内生细菌以芽孢杆菌属Bacillus为优势属，占到81.8%，芽孢杆菌属中B.megaterium为凤丹根部优势细菌，其次B.cereus，它们分别占分离内生细菌总菌株的32.4%，14.1%。 　　2.2内生菌对病原菌的抑制作用 　　2.2.1病原细菌 菌活性大小根据抑菌圈直径划分为强（15 mm）、中（10～15 mm）、弱（5～10mm）。在凤丹内生菌中，对金色葡萄球菌有较强抑制作用的内生细菌有P.chlororaphis，内生真菌有F.oxysporum’F.nematophilum’Gibberella intermedia’抑菌圈直径分别达到25.0，19.0，18.1，10.3 mm。内生细菌B.megaterium对枯草杆菌的抑菌圈直径达到24.0 mm。内生真菌F.nematophilum不仅对金色葡萄球菌具有较强抑制作用，对.大肠杆菌的抑菌圈直径也达到了20.2 mm（表4）。 　　2.2.2病原真菌 凤丹内生菌中，有8株内生菌对病原真菌有不同程度的抑制作用 　　其中对黑线炭疽菌抑制效果好的有内生真菌Tha