经前舒对大鼠海马神经元细胞ERβ蛋白和基因表达的影响.doc

　　经前舒对大鼠海马神经元细胞ERβ蛋白和基因表达的影响 【摘要】 　　目的观察经前舒颗粒对大鼠海马神经元ERβ蛋白和基因表达的影响，探讨经前舒颗粒 治疗 经前期综合征（PMS）肝气郁证的作用机制。方法 以束缚造模法复制PMS肝气郁证大鼠模型，给药组给予调肝方药经前舒颗粒，模型组给予灭菌饮用水，并设不造模正常组，取各处理组血清，对体外培养大鼠海马神经元细胞进行干预；采用蛋白质印迹技术（S edicated serum intervene and in vitro culture hippocampal primary neurons ;then detect the variety of ERβ protein and gene expression prove the abnormal conditions of the expression.ConclusionThe Jingqianshu granule can doay be one of the mechanism to treat PMS ; Neural cells; Estradiol Receptor beta 　　经前期综合征（premenstrual syndrome，PMS）肝气郁证是指严重影响正常生活的一组与月经周期密切相关、可预见的经前症状，其主要症状为易激惹、焦虑、抑郁等情绪不稳定的主观症状，其特点为黄体期（月经周期最后两周内）出现症状，月经来潮后症状自行消失［1，2］。PMS肝气郁证是PMS的主要亚型，是肝疏泄不及的表现。经前舒颗粒含白芍、当归、柴胡、白术、丹皮、香附等中药组分具养肝解郁。理气消胀功效，可显著提高PMS肝气郁证临床治愈率。本实验制备大鼠含药血清，并通过Plus、Taq HS（不含dNTP Mixture）、Rnase Inhibitor、dNTP Mixture、RT反转录试剂盒（宝生物工程大连有限公司提供）；引物：ERβ上游F5′-TCA CCG TCG AGC CTT AGT TC -3′下游R5′-TCT GCA TAG AGG AGC GAT GA -3′（286bp）；内参β-actin 上游F5′-AGG GAA ATC GTG CGT GAC-3′下游R5′- CAA AGA AAG GGT GTA AAA CG -3′（552bp）（济南博亚生物工程技术服务有限公司合成）。 　　1.4 仪器CO2培养箱（上海力新有限公司）；倒置显微镜（ 中国 重庆光电有限公司）；TECAN酶标仪（上海麦莎生物科技有限公司）；721分光光度计（上海精密仪器仪表有限公司）；凝胶成像分析仪（上海复日科技有限公司）；PCR扩增仪（TAKARA）。 　 　2 方法 　　2.1 含药血清的制备筛选动情周期规则的SD大鼠36只进入实验，并随机分为正常组，模型组和给药组，每组12只，饲养于昼夜颠倒环境。根据 文献 方法［3］并加以改进，将拟造模大鼠（模型组和给药组）前足与对侧后足用无菌纱布捆缚，妨碍其自由活动，以大鼠稍能活动、取食为度。造模同时给药组大鼠给予经前舒颗粒（1 ml/100 g体质量，相当于人临床8倍剂量［4］）。模型组、正常组大鼠给予相同体积的灭菌饮用水，1次/d，连续5 d。造模完毕断头取血，离心，收集血清，-70℃保存。用前56℃、30 min灭活，0.45 μm微孔滤膜滤菌。 　　2.2 大鼠海马神经元培养及细胞相对活力测定 参考 文献方法［5］，取新生SD大鼠大脑海马区进行神经元体外原代培养，MTT检测神经元存活率。将细胞接种在96孔板中，种植浓度1×106/ml，置于37℃、5% CO2培养箱中培养，分别在培养24，48 h后全量换液。细胞分3组，分别加入正常组大鼠血清、 模型组大鼠血清、 给药组大鼠血清，使其最终浓度为10%（V/V）。细胞培养72h后，每孔加入20 μl 0.5%MTT溶液；继续培养4 h，去上清，每孔加入150 μl DMSO，置培养箱15 min；用酶标仪于490 nm波长测定各孔吸光度值。细胞培养分组及加入大鼠血清（同前），继续培养24 h，消化收集对数生长期细胞，PBS 洗涤，-70℃放置备用。 　　2.3 蛋白质免疫印迹技术（Plus总RNA提取试剂盒操作说明提取总RNA,紫外分光光度仪检测纯度，A260/A280≈1.8，反转录（RT）按照Promega的反转录试剂盒进行操作，PCR扩增条件为：95℃，3 min，预变性；94℃，30 s，变性； ERβ 62℃，内参61.8℃，45 s,退火；72℃，1 min，延伸；再72℃，7 min，延伸。循环参数为：ERβ为33，内参为25。PCR产物于2%琼脂糖凝胶电泳，应用Smartview生物电泳图像分析系统进行光密度扫描。