脂多糖对脐血CD34+细胞体外增殖的影响.docVIP

　　脂多糖对脐血CD34+细胞体外增殖的影响 【关键词】 胎血;干细胞;细胞增殖;脂多糖类 　　[ABSTRACT] Objective: To study the effect of lipopolysaccharide (LPS) on cord blood hematopoietic stem/progenitor cells proliferation in vitro, and explore the neadelipopolysaccharide and standardlipopolysaccharideat different concentrations respectively, the cord blood hematopoietic stem/progenitor cells adelipopolysaccharide and standardlipopolysaccharide at different concentrations could promote proliferation of cord blood CD34+ cells in LPS at loL and 10mg /L respectively. Conclusion: Lipopolysaccharide may play a role in regulating the cord blood hematopoietic stem/progenitor cells proliferation in vitro. 　　[KEY CO15A日本)、医用净化工作台(J875DA苏州净化设备公司)、台式低速离心机(LD52A北京医用离心机厂)、倒置相差显微镜(OLYMPUS IMTI日本)、EPICSXL 型流式细胞分析技术(COI 1640(Gibco 公司)、淋巴细胞分离液(1.077 g/mL,上海试剂二厂)、新生小牛血清(杭州四季青)、四甲基偶氮唑(MTT)(Sigma, U.S.A)、标准脂多糖(Sigma , U.S.A) 、自制脂多糖(由本院李延平教授自制)。 　　1.3 方法和步骤 　　1.3.1 脐血CD34+细胞的分选 (1)脐血单个核细胞的分离：加入2倍RPMI1640培养液稀释脐血，室温轻摇10 min充分混匀，按1∶1的比例将稀释后的脐血液沿管壁缓慢加入装有淋巴细胞分离液的离心管上层，小心不要混匀;小心收集界面层的单个核细胞，加入PBS中，20 ℃ 1 200 r/min离心15 min洗涤2次;沉淀细胞团加入3 mL RPMI 1640培养基，充分混匀后计数细胞数和台盼蓝拒染细胞活力检查;在3 min内，用血球计数板分别计数活细胞和死细胞。镜下活细胞拒染，死细胞被染成蓝色。 　　(2)脐血单个核细胞的CD34+细胞的分选：应用德国美天旎生物技术公司的磁分选器和单克隆抗体免疫磁珠(阳性)分选法进行提取。 　　1.3.2 观察脂多糖对脐血CD34+细胞体外增殖的影响 (1)脐血CD34+细胞接种: 配制含脐血CD34+细胞的溶液, 参照 文献 [2]液体培养体系为RPMI 1640含终浓度为20%FBS, BSA(10g/L), GMCSF(10 μg/L), SCF 10 μg/L, IL3 10 μg/L，脐血CD34+细胞终浓度1×105/mL，50 μL/孔，种入96孔培养板，每组平行3孔，重复2板。 　　(2)脂多糖刺激: 按50 μL/孔，终浓度分别为0 U/mL, 0.1 U/mL, 0.3 U/mL, 1.0 U/mL, 3.0 U/mL, 10 U/mL, 30 U/mL的自制脂多糖及终浓度分别为0 mg/L, 0.1 mg/L, 0.3 mg/L, 1.0 mg/L, 3.0 mg/L, 10 mg/L, 30 mg/L标准脂多糖，分别加入50 μL/孔上述溶液中。 　　1.3.3 脐血CD34+细胞活力检测 各孔样本混匀，行台盼蓝排斥实验,活性细胞 计算 公式为:活细胞率(%) = 活细胞总数×100%/(活细胞总数+ 死细胞总数) 　　1.3.4 MTT试验检测 参照文献[2，3] 进行, 细胞接种于96孔培养板后， 37 ℃、5%CO2孵箱中培养3 d，每孔加入MTT(5g/L)20 μL, 继续培养4 h, 离心吸弃培养基，加入DMSO 100 μL，于微量振荡器上振荡20 min，待紫色结晶完全溶解后，用M550型ELISA READER酶标仪测定各组细胞的A570吸光值, 以0 μmol/L为对照组计算脂多糖作用下脐血CD34+细胞增殖率(ER)。增殖率(ER)=(用药组A值/对照组A值1)×100%。计算最佳效应浓度。 　 1.3.3 实验分组 对照组