血管内皮生长因子C反义脱氧寡核苷酸对肺癌A549细胞株侵袭力的影响.docVIP

　　血管内皮生长因子C反义脱氧寡核苷酸对肺癌A549细胞株侵袭力的影响 ：彭传亮 丛波 田辉 孙启峰 赵小刚 贠灿华 【摘要】 目的 研究血管内皮生长因子C(VEGFC)反义寡核苷酸(antisense oligodeoxyribonucleotide ，ASODN)对人肺癌细胞株A549 体外侵袭力的影响。方法 应用脂质体介导的VEGFC正义、反义寡核苷酸转染人肺癌细胞株A549细胞，并设对照组，检测癌细胞的侵袭力变化。结果 经VEGFC ASODN转染的A549细胞株黏附能力显著降低(Plt;0.01)，对重组基底膜体外侵袭能力明显减弱(Plt;0.01)。结论 VEGFC ASODN能够明显抑制肺癌细胞株A549体外侵袭力。 【关键词】 血管内皮生长因子C;反义;寡核苷酸;A549细胞;肺癌;侵袭力 肺癌是我国目前最常见的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率逐年上升,尽管以手术为主的综合 治疗 取得较大进步，但其预后仍不尽人意，有必要尝试寻找治疗肺癌的新途径。经淋巴管转移是肺癌重要的转移途径，血管内皮生长因子C(VEGFC)作为血管内皮生长因子家族成员之一，在癌周组织存在一定程度的表达，并具有促进肿瘤细胞生长、促进血管生成的作用〔1〕，因此能够成为肺癌基因治疗的极好靶点。目前关于肺癌VEGFC靶向治疗的研究较少〔2〕，本研究采用VEGFC反义寡核苷酸(antisense oligodeoxyribonucleotide，ASODN)转染肺癌细胞株A549，探讨其对肺癌细胞侵袭能力的影响，为肺癌的基因治疗提供有意义的理论依据。 　　 1 资料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 肺癌细胞株 人肺癌细胞株A549购自中科院上海细胞所,将其接种于含10%小牛血清的RPMI1640培养基，置37℃、5%CO2培养箱中常规培养至80%后备用。 　　1.1.2 主要试剂 寡核苷酸(oligodeoxyribonucleotide，SODN)、ASODN由上海生物工程公司合成并硫代磷酸化修饰;阳离子脂质体LipofectamineTM2000(LIP)为美国Invitrogen公司产品;RPMI1640(含L谷氨酰胺)培养液为Gibco BRL公司产品;Matrigel、TransineTM2000说明书，寡核苷酸(μg)∶LIP(μl)=1∶2.5比例混合配制。根据转染复合物的类别分为4组：空白对照组;LIP组(LIP转染);SODN组(SODN转染);ASODN组(ASODN转染)，终浓度1 333 ng/ml，荧光显微镜下观察转染30 min细胞内便有荧光标记的寡核苷酸出现，随着时间的延长，细胞内的荧光越来越强，转染6～12 h细胞内的荧光最强,转染率70%左右。转染48 h后收集细胞进行检测。 　　1.2.2 黏附实验 将96孔板用Matrigel 5 μg包被，2%BSA封板处理。每孔加入5×104个不同预处理肺癌细胞，置37℃、5%CO2培养箱培养，分别于30、60、90、120 min各时间点弃去培养液，PBS冲洗除去未黏附的细胞。每孔加MTT 20 μl，以及无血清RPMI1640 200 μl，CO2培养箱孵育4 h;吸弃上清液，加DMSO 200 μl振荡10 min后，自动酶标仪570 nm测各孔吸光度(A570)值， 计算 细胞黏附率。每组设6个复孔，重复3次。细胞黏附率=(实验组A570值/对照组A570值)×100%。 　　1.2.3 侵袭实验 将基质胶按40 μl/孔均匀地铺在侵袭小室聚碳酯膜上,成胶30 min后,置紫外灯下照射过夜，实验前30 min再次成胶。取不同预处理细胞各104个(RPMI1640液200 μl)分别接种到成胶的侵袭小室上,在24孔板内加入NIH/3T3细胞上清液(趋化因子)，每孔600 μl，37℃，5%CO2培养24 h后取出侵袭小室，用棉签头擦掉基质胶，PBS液洗3次，95%乙醇固定15 min，HE染色，揭下侵袭小室聚碳酯膜反贴在载玻片上。结果判定：400倍光镜下随机计数5个视野的穿膜细胞数，取均值。实验重复3次。 　　1.3 统计学方法 数据以x±s表示，采用SPSS12.0软件进行方差分析和q检验。 　　 2 结 果 　　2.1 VEGFC ASODN对肺癌细胞黏附能力的影响 随着时间的延长，各处理组细胞黏附能力均增加;同一时间点ASODN组 　　细胞黏附率较其他三组明显降低(Plt;0.01)，空白对照组、LIF组和SODN组之间差异不显著(Pgt;0.05)，见表1。表1 MTT法检测处理后各组细胞不同时间的黏附率(x±s) 　　2.2 VEGFC ASODN对肺癌细胞侵袭能力的影响 与空白对照组、LIF组和