辛伐他汀对人慢性粒细胞白血病细胞K562基因表达的影响.docVIP

　　辛伐他汀对人慢性粒细胞白血病细胞K562基因表达的影响 ：黄文芳，杨永长，传良敏，刘华，曾娅莉，周定安，胥国强，刘文 【摘要】 　　目的 应用基因芯片技术研究辛伐他汀对K562细胞基因表达的影响，初步探讨其作用机理。方法 辛伐他汀作用K562细胞48h后，提取细胞总RNA。纯化mRNA后再逆转录为cDNA，将cDNA在体外转录合成cRNA，用随机引物反转录为cDNA，用Klenovastatin on gene expression profiles of K562 cells and to elucidate its mechanism. Methods The total RNA of K562 cells treated vastatin for 48h primers. cDNA labelled Cy3 and Cy5 by Klenoe ages e RTPCR. Results There vastatintreated group and untreated group, including 16 unidentified genes. Expression of 25 genes ent group pared to the untreated group. According to the functions of these genes, they ed by real time RTPCR. Conclusion Simvastatin can regulate expression of many genes in K562 cells, ight provide novel foundation for its anticancer mechanism. 　　KEY L)细胞系。CML是一种与染色体异常有关的癌症，占整个白血病发病率的20%。CML细胞中，BCRABL持续激活Ras信号途径，细胞无限增殖且凋亡受阻，阻断Ras信号转导是目前CML 治疗 的主要策略。他汀类药物是80年代后期开发的一类羟甲基戊二酸单酰辅酶A(3hydroxy3methylglutaryl CoA, HMGCoA)还原酶抑制剂，能抑制胆固醇合成，目前已广泛用于临床治疗高胆固醇血症。研究发现他汀类药物能阻止肿瘤细胞Ras分子活化，协同抗肿瘤药物诱导细胞死亡[1]，提示他汀类药物可用于治疗CML。辛伐他汀是他汀类药物的一种已有研究表明辛伐他汀能抑制K562细胞增殖并诱导其凋亡[2]，但其具体机制目前尚不完全清楚。本实验采用基因芯片技术分析了辛伐他汀处理K562细胞后基因表达的变化，为探讨其作用机制提供了重要线索。 　 　1 材料与方法 　　1.1 材料与试剂 　　辛伐他汀购自 中国 药品生物制品检定所，人慢性粒细胞白血病K562细胞系购自四川大学华西免疫室，MMLV逆转录酶，TRI Reagent购自美国Invitrogen，Rnasin、Klenoer Random Primer购自上海博亚生物技术有限公司。cDNA Synthesis Kit、T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System购自美国Promega。PCR NucleoSpin Extract II Kit，RNA Cleanup Kit购自德国MACHEREYNAGEL。人类全基因组表达芯片，LuxScan 10KA双通道激光扫描仪由CapitalBio公司提供。 　　1.2 细胞培养与药物处理 　　收集对数生长期细胞，调整细胞浓度为1.0×105个/mL，实验组加入辛伐他汀，其终浓度为20μmol/L，对照组加入等量与实验组乙醇浓度相同的RPMI 1640培养液，37℃、饱和湿度、50mL/L CO2条件下培养48h后收集细胞。 　　1.3 RNA抽提与纯化 　　TRI Reagent提取细胞总RNA(操作按Invitrogen公司RNA提取试剂盒说明书)，采用德国MACHEREYNAGEL的RNA Cleanup Kit(参照RNA Cleanup Kit纯化说明书)纯化RNA。 纯化后的总RNA用12g/L甲醛变性凝胶电泳检测RNA的质量。 　　1.4 荧光探针的制备 　　取5μg total RNA，以T7Oligo(dT)15为引物，用cDNA Synthesis Kit合成双链cDNA；双链合成后用PCR NucleoSpin Extract Ⅱ Kit纯化。用T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System将双链cDNA进行体外转录合成cRNA；然后用RNA Cleanup Kit纯化