正交实验设计优化白木香ISSR-PCR反应体系的研究.pdfVIP

药 物 生 物 技 术 Pharmaceutical Biotechnology 2008，15(1)：31～34 31 正交实验设计优化白木香ISSR—PCR反应体系的研究 申彦晶 ，赵 翱 ，赵树进 (1．广州军区广州总医院药学部，广东广州 510010； 2．仲恺农业技术学院轻工食品学院，广东广州510225) 摘 要 利用正交实验设计的方法，对白木香IssR_PcR(简单重复序列区间一多聚酶链式反应)反应体系 中的5种主要因素(dNTP、M 、模板DNA、引物和Taq酶)在4个水平上进行优化筛选，建立了白木香ISSR- PCR反应的最佳体系(25 1)为：dNTP 0．2 mmol／L、Mg 2．5 mmol／L、引物0．5 tLmol／L、模板DNA 100 ng和 Taq酶1．0 U。通过梯度PCR反应得到相应引物的最佳退火温度为49．20C。这一体系的建立为今后利用ISSR 标记技术研究白木香的遗传多样性提供了标准化程序。 关键词 正交设计；ISSR-PCR；白木香 中图分类号：R282．7 文献标识码：A 文章编号：1005 8915(2008)01—0031—04 白木香(Aquilaria sinensis(Lour．)Spreng) 板。用于反应体系稳定性检测的白木香分别采自 是瑞香科沉香属多年生常绿木本药用及香料植物， 华南植物园、东莞植物园、深圳仙湖植物园、茂名电 白木香以其含树脂的木材人药，药材名为沉香，是 白县白木香GAP生产种植基地、湛江遂溪南药试 我国传统名贵药材和名贵天然香料_1]。其味辛、 验场、广西药用植物园、广西陆川良田镇石垌村、海 苦，性微温，具行气止痛、温中止呕、纳气平喘的功 南屯昌、云南西双版纳热带植物园和云南纳版河自 效，用于治疗胸腹胀闷疼痛、胃寒呕吐呃逆、肾虚气 然保护区。 逆喘急等_2]。白木香是我国生产药材沉香的唯一 1．2 仪器和试剂 植物资源，1999年被列为国家二级重点保护野生 用于ISSR—PCR反应的Taq酶及标准分子 植物[ 。 量(Marker)DL2 000均购自TaKaRa公司。初 ISSR(inter simple sequence repeat，简单序列 步筛选出的引物P1[(CA) AG]作为此次正交 重复区间)分子标记技术¨4]自应用以来，便以其相 实验的固定引物，由上海生工生物工程公司 对可靠的重复性和稳定性，广泛应用于品种鉴定、 合成。 系统进化、遗传多样性等方面的研究¨5 ]。本文采 1．3 总DNA的提取与浓度测定 用正交实验设计_8叫o]的方法，对白木香ISSR反应 采用改良CTAB法_11]提取白木香基因组 体系进行优化筛选，并对PCR反应程序中的退火 DNA，经0．8 的琼脂糖电泳检测DNA质量，用 温度进行梯度检测，以期获得稳定可靠的白木香 紫外分光光度计测定 DNA的含量，并稀释至 ISSR-PCR反应体系，为进一步进行白木香遗传多 5O ng／ul，--20℃保存备用。 样性研究奠定基础。 1．4 PCR正交实验设计 为了确定 PCR反应中 5个因素(dNTP， 1 材料与方法 Mg抖，模板DNA，引物和Taq酶)的最佳水平，采 1．1 材料及来源 用正交设计L (4 )进行实验，设计方案见表1和 用于反应体系优化的白木香采自东莞植物