限制性内切酶restrictionendonuclease.PPT

R F L P 限制性片段长度多态性 R F L P Restriction Fragment Length Polymorphism 是随着生物技术若干领域的发展而产生的一种分子标记技术 一． 限制性内切酶（restriction endonuclease） 1. 简 介 限制性内切酶是一类具有特殊功能的核酸切割酶，不同的内切酶可辨认并作用于特异的DNA序列，并将 DNA切断 I 型 酶: 如酶的识别位点上两条DNA链均未甲基化，就行使内切酶功能，但切割点不在识别位点，而在1kb（不少于400bp）或nkb(最多7kb)处随机切割；如一条DNA链是甲基化，就行使甲基化酶功能，使另一条链甲基化；如两条链均已甲基化，则酶与DNA链解离。 III 型 酶 与I型酶特性类似，也有甲基化功能。不同的是它能在DNA链上的特异位点切割，其切割位点在识别位点以外，对基因工程的意义也不大。 II 型 酶 就是通常指的DNA限制性内切酶，II型限制酶分子量小、仅需Mg2＋作为催化反应辅助因子。它们能识别双链DNA的特异顺序，并在这个顺序内进行切割，产生特异的DNA片段。 II型限制性内切酶的最大特点是识别DNA特异顺序并进行切割，因而在基因重组、DNA序列分析、基因组甲基化分析及基因物理图谱等技术中广泛应用。 2. 性质和特点： 分子大小 20－100kdal 作用条件 对离子强度要求高 识别顺序 大多4－6bp 迴文结构 切口 就在识别顺序内 同工异源酶 （isoschizomer） 不同来源分离出来，但具有相同识别顺序，切割DNA方式可以相同，也可以不同。 Sma I Xma I C C C G G G C C C G G G G G G C C C G G G C C C 同尾酶（subset） 不同的酶但切割后突起的核苷酸序列相同，可相互连接，重组后可能不被原先酶识别。 BamH I: GGATCC CCTAGG Bgl II: GGATCT AGATCT CCTAGA TCTAGA 远距离裂解酶（distant  cleavage） 识别位点与切割位点不一致，切割点在识别位点旁10bp左右，如Mb2 识别顺序GAAGA,切割位点在下游第8个bp。 可 变 酶 识别顺序中1个或几个核苷酸是可变的，识别顺序6bp。 如Bgl I 识别GCC(N5)GGC, 其N5为5个可变碱基。 3. 内切酶活性定义： 在适当反应条件下，1小时内完全酶解1?g特定DNA底物所需要的限制性内切酶的量，为一个活性单位。 二、DNA限制性内切酶酶 切图谱 限制性内切酶图谱：也称DNA物理图谱，是DNA链上某些限制性内切酶酶切位点的图谱，可作为DNA片段的特殊标记。是DNA特征的证据。 识别4个核苷酸的内切酶，在DNA链上出现机率为: 1 / 44＝1 / 256bp 识别6个核苷酸的内切酶，在DNA链上出现机率为: 1 / 46 ＝ 1 / 4.1kb 识别8个核苷酸的内切酶，在DNA链上出现机率为: 1 / 48＝1 / 65.5kb DNA限制性内切酶酶切图谱的建立 A、部分酶解法： ①完全酶解 3 ，2， 1 kb ②部分酶解 6，5，4，3，2, 1 kb ③分析 5=3+2 4=3+1 3在中间 B.两种以上限制性内切酶交叉酶解法： 总长 EcoRⅠ HpaⅡ 3kb 1.7，0.9，0.4 1.6，1.4 EcoRⅠ+ HpaⅡ 1.2 , 0.9 , 0.5 , 0.4 总长 EcoRⅠ HpaⅡ3kb 1.7，0.9，0.4 1.6，1.4