41207024荧光分光广度法测纤维素的含量.docxVIP

荧光分光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素B2的含量2012级化学一班学号名：宗潇潇实验目的1、学习荧光分光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素B2的分析原理。2、掌握荧光分光光度计的操作技术和测定多维葡萄糖粉中维生素B2的方法。实验原理1.荧光光度法原理?（1）常温下，处于基态的分子吸收一定的紫外可见光的辐射能成为激发态分子，激发态分子通过无辐射跃迁至第一激发态的最低振动能级，再以辐射跃迁的形式回到基态，发出比吸收光波长长的光而产生荧光。在稀溶液中，荧光强度IF与物质的浓度c有以下的关系：IF?=2.303?I0kbc??当实验条件一定时，荧光强度与荧光物质的浓度成线性关系：?IF=KC??这是荧光光谱法定量分析的理论依据。?（2）荧光分析法的特点：?a.?与紫外-可见分光度法比较，荧光分析法具有更高的灵敏度。?b.?选择性好。荧光法既能依据发射光谱，又能依据吸收光谱来鉴定物质。?c.?所需试样量少、操作方法简便。?（3）荧光光谱?激发光谱：固定测量波长(选最大发射波长)，化合物发射的荧光强度与照射光波长的关系曲线。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大。?发射光谱：固定激发光波长(选最大激发波长),?化合物发射的荧光强度与发射光波长关系曲线。?固定发射光波长进行激发光波长扫描，找出最大激发光波长，然后固定激发光波长进行荧光发射波长扫描，找出最大荧光发射波长。激发光波长和发射荧光波长的选择是本实验的关键。?2.荧光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素B2的含量维生素B2（又叫核黄素，VB2）是橘黄色无臭的针状结晶，其结构式为：维生素B2易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂，在中性或酸性溶液中稳定，光照易分解，对热稳定。维生素B2溶液在430～440 nm蓝光的照射下，发出绿色荧光，其峰值波长为525 nm。VB2的荧光在pH=6～7时最强，在pH=11时消失。维生素B2在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为光黄素，光黄素的荧光比核黄素的荧光强的多，故测VB2的荧光时溶液要控制在酸性范围内，且在避光条件下进行。多维葡萄糖中含有维生素B1、B2、C、D2及葡萄糖，其中维生素C和葡萄糖在水溶液中不发荧光，维生素B1本身无荧光，在碱性溶液中用铁氰化钾氧化后才产生荧光，维生素D2用二氯乙酸处理后才有荧光，他们都不干扰维生素B2的测定。实验仪器与试剂日立R-7000荧光仪5 mL吸量管1只，2 mL吸量管1只， 50 mL容量瓶7只10.0μg·mL-1VB2标准溶液（置阴暗处保存），冰乙酸（AR），多维葡萄糖粉试样四、实验步骤1.打开氙灯，再打开主机，然后打开计算机启动工作站并初始化仪器。仪器初始化完毕后，在工作界面上选择测量项目，确定最大激发波长和最大发射波长（测得最大激发波长为445nm,最大发射波长为526nm）2. 标准系列溶液的配制及标准溶液荧光强度的测定：在六个干净的50 mL容量瓶中，分别吸取0.50、1.00、1.50，2.00 、2.50和3.00 mL VB2标准溶液，各加入2.00 mL冰乙酸，稀释至刻度，摇匀。从稀到浓测量系列标准溶液的荧光强度。3. 未知试样的测定:称取0.15-0.20 g多维葡萄糖粉试样,用少量水溶解后转入50 mL容量瓶中，加2.00 mL冰乙酸，稀释至刻度，摇匀。用测定标准系列时相同的条件，测量其荧光强度。4.退出主程序，关闭计算机，先关主机，最后关氙灯。五、实验结果及数据处理1.?用标准系列溶液的荧光强度绘制标准工作曲线。浓度（μg/ml）荧光强度123平均值0.143.8543.9443.8743.890.285.3785.2184.9685.180.3129129.3129.5129.270.4157.7156.6156.4156.90.5196195.8195.8195.870.6226.8226.4227.2226.82未知样品浓度的测定称取多维葡萄糖粉0.1674g??????????????????根据待测液的荧光强度，从标准工作曲线上求得其浓度，计算出试样中含量。次数123平均值荧光强度（I）74.7473.2172.9673.64浓度（μg·mL-1）0.17170.16750.16680.1687浓度RSD=1.57%维生素B2百分含量=?(0.1687×50×10-6)/0.1674×100％=0.005％六、实验应注意事项?1.使用970CRT时，要按照仪器使用规定使用，不可随意操作。?2.使用比色皿时，要注意勿用手直接触摸比色皿表面，因握住侧棱。?七、思考题?1.?试解释荧光光度法较吸收光度法灵敏度高的原因??答：荧光强度与激发光强度成正比，提高激发光强度，可成倍提高荧光强度。同时，提高仪器灵敏度，也可提高荧光光度法的灵敏度。而对于吸收光度法