炉甘石薄荷脑洗剂微生物限度检查方法建立及验证.doc

炉甘石薄荷脑洗剂微生物限度检查方法建立及验证摘要 采用离心沉淀法与培养基稀释法，对炉甘石薄荷脑洗剂进行微生物限度检查，结果表明各验证菌回收率在70％以上，表明该方法可行。? 关键词 炉甘石薄荷脑洗剂 微生物限度?? 炉甘石薄荷脑洗剂是常用的医院制剂，其成分为炉甘石、氧化锌、薄荷脑、苯酚、甘油等。具有止痒、轻度收敛、保护皮肤的作用，用于湿疹、皮炎、皮肤瘙痒症等，应对微生物限度进行控制。? 仪器与试药? 仪器：HH.BII.420电热恒温培养箱，LRH-250A生化培养箱，Sartorius BS 2002S电子天平，SA-1480-Ⅱ净化工作台，TDL80-2B离心机。? 培养基：（中检所）营养琼脂培养基，玫瑰红钠琼脂培养基，胆盐乳糖培养基，营养肉汤培养基，MUG培养基，曙红亚甲蓝琼脂培养基，溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基，甘露醇氯化钠琼脂培养基。? 方法与结果? 菌种：枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501、金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003、大肠埃希菌CMCC(B)44102、白色念珠菌CMCC(F)98001、黑曲霉CMCC(F)98003（以上菌株均为第三代）。? 菌液制备：取经30～35℃ 培养18～24小时的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌营养肉汤培养液1ml，加0.9%无菌氯化钠至每毫升含菌50～100cfu/ml，备用。? 取经23～28℃ 培养24～48小时的白色念珠菌改良马丁培养液1ml，加0.9%无菌氯化钠至每毫升含菌50～100cfu/ml，备用。? 取经23～28℃ 培养5～7天的黑曲霉改良马丁营养琼脂斜面，用0.9%无菌氯化钠3～5ml将孢子洗脱，加0.9%无菌氯化钠至每毫升含菌50～100cfu/ml，备用。 供试液的制备：取供试品原液10ml，加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀。吸取上述混合液30ml,以500转/分的速度离心5分钟，取上清液，以3000转/分的速度离心20分钟，弃去上清液，沉淀加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液补至30ml，作为1∶[KG-*2]10的供试液。? 方法验证过程：验证试验进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌的回收率。 试验组：细菌，取1∶[KG-*2]10供试液1ml及 50～100cfu试验菌至同一平皿中，立刻倾注营养琼脂培养基，每株菌株（大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌）做2份平行试验。霉菌及酵母菌：取1∶[KG-*2]10供试液1ml及 50～100cfu试验菌至同一平皿中，立刻倾注玫瑰红钠琼脂培养基，每株菌株（白色念珠菌、黑曲霉）做2份平行试验。? 菌液组：取菌液1ml加入平皿中，立刻加入相应的琼脂，各菌株做2份平行试验。? 供试品对照组：按试验组的方法不加菌液，测定供试品的本底菌数。? 稀释剂对照液：取上述菌液（枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌）各30ml，以500转/分的速度离心5分钟，取上清液，以3000转/分的速度离心20分钟，弃去上清液，沉淀加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液补至30ml，取1ml至平皿中，立刻倾注营养琼脂培养基，每株菌株（大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌）做2份平行试验。 计算公式：? 结果：细菌、霉菌及酵母菌回收率试验采用离心沉淀法，稀释剂对照组及试验组的回收均在70%以上，表明可用上述方法检查细菌、霉菌及酵母菌（见表1、2）。? 控制菌（金黄色葡萄球菌、铜绿假单孢菌）检查方法的验证：菌种，铜绿假单胞菌CMCC(B)10104、金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003、大肠埃希菌CMCC(B)44102（以上菌株均为第三代）。? 菌液的制备：取经30～35℃ 培养18～24小时的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单孢菌营养肉汤培养液1ml，加0.9%无菌氯化钠至每毫升含菌10～100cfu/ml，备用。? 供试液的制备：取供试品原液10ml，加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml,混匀。? 金黄色葡萄球菌：①试验组：取供试液10ml及金黄色葡萄球菌10～100cfu加入营养肉汤培养基100ml中，置35℃培养箱中培养18～24小时。②阴性对照组：取供试液10ml及大肠埃希菌10～100cfu加入营养肉汤培养基100ml中，置35℃培养箱中培养18～24小时。? 结果：取两组培养物分别划线于甘露醇氯化钠琼脂培养基中，试验组检出金黄色葡萄球菌，阴性对照组未检出大肠埃希菌，表明上述方法可用于检查金黄色葡萄球菌（见表2）。? 铜绿假单胞菌：①试验组：取供试液10ml及金黄色葡萄球菌10～100cfu加入胆盐乳糖培养基100ml中，置35