益气活血化痰通络方干预Apo-E基因敲除小鼠动脉粥样硬化实验探究.docVIP

益气活血化痰通络方干预Apo-E基因敲除小鼠动脉粥样硬化实验探究摘要 目的：观察益气活血化痰通络方对Apo―E基因敲除小鼠动脉粥样硬化(AS)进展的影响。方法：24次6周龄Apo―E基因敲除小鼠普通饲料喂养4周后随机处死6只，取主动脉根部HE染色后普通光镜下观察，确定AS斑决形成。余下18只10周龄Apo―E基因敲除小鼠分为中药组及对照组各9只，分别以益气活血化痰通络方及生理盐水灌胃14周后处死。HE染色观察AS斑块的大小和血管狭窄度。酶法分析测定血脂，双抗体夹心ELISA法进行检测血白介素―6(IL―6)。结果：6周龄Apo―E基因敲除小鼠普通饲料喂养4周后主动脉根部即出现AS病变，实验结束后HE染色显示中药组较对照组斑块面积减少；前者血管狭窄度较后者显著降低(P0.01)，中药组与对照组之间实验前后血脂水平均无差异，实验结束后中药组血IL―6水平较对照组明显降低。结论：用益气活血化痰通络方可抑制动脉粥样硬化，其机制可能与降低炎症因子水平有关。 关键词 炎症 动脉粥样硬化 益气活血化痰通络方 Apo―E基因 小鼠 动脉粥样硬化(AS)是不良心血管事件的主要原因之一，近来Ross在其提出的损伤反应学说的基础上明确提出：“动脉粥样硬化是一种炎症性疾病而不是单纯由于脂质沉积所致，炎症在动脉粥样硬化的各个时期都是突出的变化，而受累的动脉数量增多，可以导致全身性炎症活性增强，表现为血浆中的炎性标志物较多。”炎症是动脉粥样硬化发生、发展的中心环节，针对炎症机制有望寻找到控制动脉粥样硬化发生发展的更有效的治疗手段，有研究表明控制炎症可独立于局部的动脉粥样硬化负荷或缺血负荷之外而改善冠心病患者的预后。不稳定斑块富含炎症介质以及含剩余游离胆固醇巨噬细胞。游离胆固醇在巨噬细胞内的堆积可以导致炎症因子IL―6的分泌。本研究选用载脂蛋白E基因敲除小鼠为动脉粥样硬化模型，用益气活血化痰通络方对其进行干预，观察该方对动脉粥样硬化斑块的影响，并进一步探讨其机制，从而阐明其可能具有的临床效应，为指导合理的临床试验和可能的临床应用提供依据。 1、材料与方法 1.1 动物分组及取材：24只6周龄雄性Apo―E基冈敲除小鼠(C57BL/6，2005年3月购于北京大学医学部，生产批号：SCY―K京2002―0001，体重20±2g)，用普通饲料喂养4周，随机处死6只，取主动脉根部，HE染色，普通光镜下观察，确定动脉粥样硬化斑块形成。中药制剂：黄芪、茶树根各300g，丹参、当归、桑椹各150g，地龙、石菖蒲、泽泻各90g，3000ml清水煮沸后，水煎浓缩成300ml，每毫升含生药4.4g，置4℃冰箱保存备用，南岳阳医院制剂室提供。余下18只Apo―E基因敲除小鼠随机分为中药组(9只)和对照组(9只)，两组行普通饲料喂养的同时，中药组每天予益气活血化痰通络方0.4ml灌胃1次(按20ml/Kg/d)，对照组每天用生理盐水0.4ml灌胃1次(同前)，共14周。实验前(10周龄)全部小鼠眶后静脉取血0.3ml，1500rpm离心10分钟，离心半径5.5cm，取血清置-70℃冰箱待测。实验结束后重复采血，处理同前。14周后处死动物，各组动物用生理盐水及4％多聚甲醛灌注后取主动脉根部，自主动脉根部至腹主动脉末端离断整个主动脉。将小鼠主动脉近心端1cm切下，制备石蜡切片，每隔4um连续横切18张，每个切片上3个组织面，每间隔6张取1张，横切面的小鼠主动脉标本，行HE染色，×10倍镜下实域分割，分别选取所有斑块，体现分析斑块面积并计数，确定血管最狭窄处。×40倍镜下观察斑块的组织学特点并统计粥样斑块病变的面积以及比较血管狭窄度后进行分析。 1.2　指标检测：①总胆固醇和甘油三酯的测定：采用酶法分析，用分光光度仪测定样本的光密度值，根据标准液与待测样本光密度值之比值计算血脂水平。试剂盒购自上海名典生物工程有限公司；②血IL―6(白介素―6)检测：采用双抗体夹心ELISA法进行检测，采血后置于玻璃管中，随即于4℃离心10分钟(3000r/min)分离血清，置于-70℃冰箱待测。使用试剂由上海博光生物科技有限公司提供。 1.3 粥样斑块大小的分析：将包埋有小鼠主动脉根部的冰冻组织包埋剂O.C.T组织块置冰冻切片机上固定，参照Paigen法自心底向主动脉方向作厚10um的横断面切片，予HE染色，显微镜下观察。在病理组织实时摄像显微镜系统下采图，运用“多功能真彩色病理图像分析系统”软件分析各组织切片的斑块面积，统计血管狭窄度。 1.4　统计学分析：用SPSS10.0软件包建立数据库，组间比较用单因素方差分析进行统计，各指标用均数±标准差表示，P0.05表明差异有显著性。 2、结果 2.1 6周龄Apo―E基因敲除小鼠普通饲料喂养4周后主