硫酸皮肤素衍生物对炎性肠病患者血小板表面分子影响.docVIP

硫酸皮肤素衍生物对炎性肠病患者血小板表面分子影响摘要：目的研究硫酸皮肤素（DS）衍生物对炎性肠病（IBD）患者血小板表面P-选择素及活性蛋白C（APC）的影响。方法用氯磺酸磺化制备多硫酸化DS（PSDS）。测定其1H-NMR和13C-NMR光谱确定主要双糖单位。用过氧化氢降解DS和PSDS，所得片段用凝胶过滤色谱分离。用ELISA法测定DS衍生物对血小板表面P-选择素的影响，用底物显色法测定其对APC活性的影响。结果组成DS和PSDS链的主要双糖单位分别为IdoA-1→3-GalNAc-4-SO3和IdoA-2SO3-1→3-GalNAc4,6-diSO3。与二磷酸腺苷（ADP）组和IBD组相比，DS及其衍生物都具有抑制P-选择素表达的作用（P Key words：dermatan sulfate derivative; inflammatory bowel disease; P-selectin; activated protein C 炎性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）是一种慢性非特异性肠道炎症。近期研究表明，炎症和凝血之间有着众多联系，IBD患者患静脉血栓的几率更高[1-6]。在溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病（CD）患者中发现血小板活动异常，这种异常现象对加重炎症有重要作用。P-选择素（又称p-选凝素）是在激活的血小板和内皮细胞表面表达的一种膜糖蛋白，它在血栓形成和炎症反应过程中起重要作用[7]。P-选择素拮抗作用减少了静脉血栓动物模型的血栓形成和炎症发生[8]。蛋白C抗凝通路似乎是联系炎症和凝血的主要通路。激活蛋白C（APC）参与系统性凝血和抗凝过程[9]。APC可以通过抑制凝血酶产生和白细胞活性减轻器官的损害[10]。抑制P-选择素释放、促进APC活性有助于治疗IBD和相关的血栓疾病[11]。 硫酸皮肤素（DS）是一种结构复杂、硫酸化的线形糖胺聚糖（GAGs），其结构中主要包括[4-α-L-IdoA-1→3-β-D-GalNAc-1]n 和 [4-α-L-GLcA-1→3-β-D-GalNAc-1]n 及其衍生物L-IdoA的C-2硫酸化、D-GalNAc的C-4 和/或 C-6硫酸化。天然DS的相对分子质量（Mr）为（15~45）×103。多硫酸化DS（PSDS）是DS与氯磺酸反应后的硫酸化产物。DS衍生的寡糖（DS-Oligs）是指DS和PSDS降解后的寡糖。DS是存在于许多动物组织中的一种重要的糖胺聚糖。最近，越来越多的证据表明，与深入研究的肝素和硫酸乙酰肝素一样，DS是许多细胞活动的影响因子。DS蛋白聚糖的许多生物学活性与其糖胺聚糖的结构密切相关[12]。除了抗凝和抗血栓功能外，DS还具有抗炎活性[13]，但其抗炎机制还不明确。迄今DS寡糖的分子结构与它对P-选择素和APC活性的影响之间关系的研究还是空白。本研究的目的是观察不同Mr、不同结构的DS寡糖对IBD患者血小板表面P-选择素表达和血浆APC活性的影响，并阐述DS治疗IBD的抗炎机制。 1材料和方法 1.1材料 DS（东营天东生化工业有限公司惠赠）；30 %过氧化氢（莱阳经济技术开发区精细化学品公司）；二磷酸腺苷（ADP, SIGMA）；Superdex-30（英国Amersham）；人P-选择素ELISA试剂盒，人蛋白C测定试剂盒（上海太阳生物技术公司）。 1.2方法 1.2.1DS-Oligs的制备DS与氯磺酸反应制备PSDS。将DS和PSDS用过氧化氢氧化降解[14]，所得产物上Superdex-30凝胶过滤色谱柱（26 mm×1200 mm），用0.25 mol/L碳酸氢铵洗脱DS-Oligs，冻干即得。 1.2.2DS-Oligs的Mr测定用HPLC测定[15]。 1.2.3DS和PSDS 13C -NMR和1H-NMR分析用600 MHz核磁共振光谱仪按文献报道的方法测定DS和PSDS的13C -NMR和1H-NMR的光谱[16]。 1.2.4患者和对照以10名健康志愿者的血液为对照组，10例IBD患者血样中5例UC患者，5例CD患者。 1.2.5血小板表面P-选择素的测量 1.2.5.1血样采集在制备血小板前准备用含3.2 ％枸橼酸钠抗凝的硅化管收集血样。 1.2.5.2制备分离血小板室温下将9 mL枸橼酸钠抗凝血样500 r/min离心20 min，吸取上层富含血小板血浆（PRP），余下血浆3 000 r/min离心15 min，获得贫血小板血浆（PPP）。用PPP调整PRP血小板至3×108个细胞/mL，用于测定P-选择素。 1.2.5.3标准曲线的制备将P-选择素标准品80 ng做5次倍比稀