维胃方对胃溃疡大鼠胃粘膜氨基己糖含量影响.docVIP

维胃方对胃溃疡大鼠胃粘膜氨基己糖含量影响关键词 维胃方 胃溃疡 氨基己糖 大鼠 实验研究 维胃方是刘晓伟教授治疗消化性溃疡的验方。我们通过对实验性大鼠胃液PH值测定、胃粘膜氨基己糖含量变化的观察，探讨维胃方治疗胃溃疡的作用机制。? 1 材料与方法? 1．1 实验动物：Wistar雄性大鼠56只，180～220g，SPF级，由南方医科大学实验动物中心提供，动物合格证号：2006A052号。室温22～26℃，安静环境下适应性饲养3天，喂以固定的平衡饲料。? 1．2 实验用药：维胃方（白及、三七、蒲公英、茯苓）均购自南方医院中药房，上述药物按一定比例混合后，按汤剂要求常规煎煮2次后浓缩取汁700ml，按人和大鼠体表面积系数换算方法，大鼠等用剂量=（人用剂量×0．018×5）g/kg，高、中、低剂量组生药量分别按1．5g/ml、0．75g/ml、0．375g/ml配制，放入4℃冰箱保存备用。雷尼替丁胶囊，每粒150mg（批号：0707146 广东佛山阿特维斯制药有限公司），按0．003g/ml浓度配置雷尼替丁混悬液200ml备用。? 1．3 主要试剂和仪器：100%冰乙酸；1．0mg/ml标准牛血清蛋白溶液；考马斯亮蓝蛋白染色液；40ml/L乙酰丙酮溶液；0．1mg/ml的盐酸氨基葡萄糖标准液；显色剂：对-二甲氨基苯甲醛试剂；8．0ml/L盐酸溶液；8．3mol/L的NaOH溶液。UV-845+紫外分光光度计（惠普上海分析仪器有限公司）；高速台式离心机LD5-2A（北京医用离心机厂）；LeicaRM2135切片机（德国）；Olympus光学显微镜（日本）。? 1．4 实验方法：详见于下。? 1．4．1 模型制备：按照文献[1]方法。将大鼠禁食24小时后，常规消毒，按3．5ml/kg体重腹腔内注射10%水合氯醛麻醉，铺上手术洞巾，自剑突下沿腹中线剪一2cm切口，将胃体移出腹腔，用直径约5mm的圆形滤纸，蘸100%冰乙酸贴于胃窦前壁60秒后还纳胃体，缝合腹肌、皮肤，缝合线处及其周围再次消毒。? 1．4．2 给药方法：根据完全随机法分7组，每组8只。正常组，正常饮食；模型组、自愈组，冰乙酸造模后，正常饮食；维胃方高、中、低剂量组，雷尼替丁组，均于造模术后第4天开始分别灌服各剂量维胃方、雷尼替丁混悬液2ml，时间7天。模型组造模术后4天麻醉处死取材；其余各组大鼠在造模术后第11天麻醉处死取材。? 1．4．3 胃液PH值、胃粘膜大体标本观察及周围粘膜病理组织检测：由大鼠胃贲门取少量胃液滴于PH试纸，测定PH值。之后沿胃大弯剪开，展平，观察胃粘膜大体标本。取部分溃疡周围腺胃组织放入含10%甲醛溶液中固定12～16h（4℃）。经常规脱水，石蜡包埋，HE染色后置光学显微镜下观察。? 1．4．4 胃粘膜中氨基己糖的测定：详见于下。? 1．4．4．1 胃粘膜匀浆上清液的制备：用玻片将新鲜腺胃部胃粘膜组织及粘液轻轻刮下,低温冷冻后称重,置于2ml生理盐水中,按常法制备成匀浆,置玻璃试管中,3000r/min离心10min，取上清液储于-20℃备用。分别用于测定蛋白和氨基己糖。? 1．4．4．2 胃粘膜蛋白含量测定[2]：根据考马斯亮蓝G-250染色法制作蛋白标准曲线。按表1操作,室温放置15min后于595nm波长处比色测定，空白管调零，比色记录吸光度，常法计算蛋白质浓度(mg/ml)。 1．4．4．3 胃粘膜氨基己糖含量测定：参考冯敬池等[3]报道的方法进行。精密称取盐酸氨基葡萄糖50mg溶解于500ml去离子水中配置成0．1mg/ml的盐酸氨基葡萄糖标准液。制备标准曲线:在试管中分别加入0．1mg/ml的盐酸氨基葡萄糖标准液0．25,0．5,0．75,1．0,1．25ml,分别加水至2．5ml,加乙酰丙酮0．5ml，置沸水浴15min，流水中迅速冷却,各加显色剂1ml,震荡混匀，置37℃水浴保温10min，空白用2．5ml去离子水代替标准样品液，空白管调零，立即于530nm波长处测定OD值。每个标本步骤同上。? 1．4．4．4 氨基己糖含量的计算:氨基己糖(mg/g)=匀浆上清液氨基己糖(mg/L)/蛋白质浓度(g/L)。每个标本测得的OD值代入标准曲线的函数，计算出每个标本的氨基己糖浓度和蛋白浓度。? 1．4．5 统计学处理：实验数据用均数±标准差（x±s）表示。用SPSS13．0软件包进行统计。? 2 实验结果? 2．1 光学显微镜下观察：①正常组：粘膜层完整，腺体排列整齐，浆膜层完整。②模型组：造模处粘膜缺损，偶及肌层，腺体完全破坏，粘膜下小动脉可见有血栓闭锁性动脉内膜炎；非造模处炎性细胞浸润严重，粘膜下层可见渗血；浆膜层有纤维蛋白渗出，亦有