肺瘤平膏及其拆方对树突状细胞抗原递呈功能影响分子机制探究 .docVIP

肺瘤平膏及其拆方对树突状细胞抗原递呈功能影响分子机制探究 朴炳奎　林洪生　熊　露　花宝金 摘　要：目的：观察肺瘤平膏及其拆方干预体外培养体系中Dc抗原递呈功能的作用并探讨其分子机制。方法：建立体外人血PBMc诱导分化成熟Dc的诱导培养体系，从健康人外周血中分离获得PBMC，采用多种细胞因子(TNFα、IL-4、GM-CSF)联合诱导，获得了分化与功能相对成熟的DC，并采用流式细胞仪检测技术，对肺瘤平膏及其拆方含药血清干预成熟DC与抗原递呈功能相关表面分子表达，及其对DC分泌IL－12水平影响进行初步研究。结果：肺瘤平膏可上调DC与抗原递呈功能相关膜分子MHC-Ⅱ、CD80、CD83、CD86及CD40的表达，并促进Dc分泌IL-12水平，其芳中扶正部分的作用不容忽视。结论：在扶正培本治则指导下的肺瘤平膏能够调节DC抗原递呈功能，提高机体的抗肿瘤免疫监视功能。 关键词：树突状细胞：肺瘤平膏：抗原递呈 树突状细胞(Dc)是目前体内已知功能最为强大的抗原递呈细胞(antigen presenting cells，APC)，其最显著的特征是能摄取、加工及递呈抗原，刺激初始型T细胞(naive Tcells)的活化和增殖，从而启动机体早期特异性抗肿瘤免疫应答。由于DC对细胞毒T细胞(CTL)识别并杀伤肿瘤细胞，以及正常机体免疫监视功能有着十分重要的意义。本研究通过对肺瘤平膏及其拆方干预健康人外周血经多种细胞西子(TNFα,IL-4、GM-CSF)联合诱导分化成熟DC膜分子表达，揭示该药调节早期抗肿瘤免疫作用机制。 1 材料和方法 1．1 材料 正常人新鲜浓缩白细胞：由北京市红十字会中心血站提供。 1．2试剂及仪器 Ficoll，Biosciences公司提供；Foetal calf 8erlLrn，Sigma公司提供；MHC-Ⅱ(FITC)F-Mab、CD40(FITC)F-Mab、CD80(FITC)F-Mab、CD83(PE)F-Mab、CD86(PE)F-Mab由Biolegend公司提供；rhTNF-α、rhIL-4、rhGM-CSF由TBDSCIENCE公司提供；IL-12兔抗人ELISA试剂盒，由武汉博士德生物工程有限公司提供。 FACSort流式细胞仪，美国Becton Dickinson公司生产；LP400型全自动酶标仪，为法国巴斯德公司产品。 1．3 方法 1．3．1 肺瘤平膏及其拆方含药血清的制备分别制备肺瘤平膏全方、益气方(黄芪、党参)、解毒方(白花蛇舌草、草河车、败酱草)、益气解毒方(白花蛇舌草、草河车、败酱草、黄芪、党参)中药的含药血清，具体方法如下。 ①药物：肺瘤平膏，由中国中医科学院广安门医院制剂中心统一制备，批准文号：(98)京卫药研字[058]DF-1657号；经生理盐水稀释为终浓度为1.71g／mL后备用。其余各拆方草药均购自广安门医院中药房，剂量以原方为准，制成浸膏后备用，其终浓度为分别为含生药2.32、3.62、2.77g/mL。②动物：大白兔。③血清采集方法：大白兔随机分为5组，分别于空腹时灌服生理盐水和各组中药汤剂10mL，中药用药剂量均按照动物体表面积折算成等效剂量，连续给药4天，共计7次，末次给药后2h从兔耳缘静脉采血8-10mL，离心取上清夜，将同组兔血清混合，56℃水浴灭活30min，0.22μm微孔滤膜除菌，分装，置于-20℃冰箱中保存。 1．3．2 DC的培养与鉴定①DC培养：采集正常人外周血浓缩白细胞，Ficoll―Hypaque密度离心分离PBMC，将经分离得到的PBMC，置入37℃5％CO2培养箱中培养2h。采用贴壁法，去除巨噬细胞，加入含有细胞因子完全PMI一1640液(含IL-4 IOOU／mL、GM-CSFIS0ng／mL、TNK-αS00U／mL)。置入37℃，5％C02培养箱中培养，隔日半换液。在倒置显微镜下每日连续观察细胞的生长状态及形态变化。待成熟后，1％胎盘兰染色，光镜下细胞计数后，根据需要，将细胞数调整到1×106／mL备用。分别用MHC-Ⅱ(F1TC)、CD80(F1TC)、CD83(PE)、CD86(PE)、CD40(F1TC)标记后，常温下静置30min，加入PBS，1500r／min，10离心洗脱，流式细胞仪检测其纯度及表达。 ②DC形态学特征及组化鉴定：光镜下形态学特征观察：于倒置显微镜下，每日观察细胞的生长状态及形态学变化，并拍照记录。扫描电镜观察：将培养第10天收获得到的DC滴于多聚赖氨酸包被的玻片，37℃温育4h后，用2.5％戊二醛固定1h,0.01M PBS冲洗3次后，1％锇酸固定90min，梯度30％、50％、70％、90％、100％乙醇脱水，扫描电镜观