肾精亏虚对小鼠视网膜细胞凋亡相关基因Bcl-2 Bax影响.docVIP

肾精亏虚对小鼠视网膜细胞凋亡相关基因Bcl-2 Bax影响摘要：目的：肾精亏虚对小鼠视网膜细胞凋亡相关基因Bcl-2、Bax的影响。方法：将30只雄性昆明小鼠用计算机取随机数法随机分为正常对照组、模型组和补肝组3组。其中模型组和补肝组采用惊恐加房劳的复合伤肾法制造肾精亏虚模型。补肝组每天给予0.3mL/10g体重的一贯煎浓缩液灌胃。正常对照组及模型组予等量生理盐水灌胃，连续给药21天。制备小鼠视网膜石蜡切片行免疫组化ABG法染色，并对染色结果进行计算机图像分析系统观察分析。结果：Bd-2和Bax在正常组阳性反应少见，且只出现于节细胞血管；模型组小鼠视网膜神经节细胞层(CCL)和内核层(INL)可见大量的阳性细胞；补肝组小鼠视网膜神经节细胞层(GCL)和内核层(INL)可见少数阳性反应细胞。各组小鼠视网膜细胞Bcl-2和Bax表达的阳性细胞率比较：模型组与正常组及补肝组比较有非常显著的差异(P＜0.01)；正常组与补肝组比较无显著的差异(P＞0.05)。结论：凋亡相关基因Bal-2和Bax在“惊恐、房劳”因素复制的肾精亏虚模型小鼠视网膜的表达增强，二者在肾精亏虚模型小鼠视网膜细胞凋亡中起重要作用。 关键词；肾精亏虚；疾病模型；视网膜；Bel-2；Bax；一贯煎 中图分类号：R-33 文献标识码：A 文章编号：1673-7717(2007)08-1628-03 1　材料与方法 1．1　实验动物 6周龄雄性昆明小鼠30只，雌性昆明小鼠300只，体重(32±2.5)g。均购自湖北省医学科学院。 1．2　药物及制备 1．2．1　一贯煎　由生地、当归、枸杞子、麦冬、沙参、川?子组成，水煎并浓缩至含生药0.5g/mL的浓缩液。 1．2．2　左炔诺孕酮烧雌醚片　北京紫竹药业有限公司生产[国药准字，批每次取18mg溶于150mL蒸馏水中，配成0.12mg/mL的长效避孕药混悬液，4℃冰箱保存备用。 1．3　造模与分组 1．3．1　动情雌鼠制　作将300只雌鼠用计算机取随机数方法随机分为5组，每组60只，分别记为A、B、C、D、E组。按文献方法，从A组开始，每天依次取l组雌鼠灌服长效避孕药左炔诺孕酮炔雌醚混悬液，灌胃剂量为0.0234mg/(10gd)，5天1个循环。每组雌鼠在灌胃后的第3天正好处于动情期。可用于复制雄鼠肾虚模型。 1．3．2　造模与分组　将30只雄性昆明小鼠用计算机取随机数法随机分为正常对照组、模型组和补肝组3组。其中模型组和补肝组采用惊恐加房劳的复合伤肾法制造肾精亏虚模型。每天每只雄鼠按照1:2的比例与动情期雌鼠合笼，每天下午8:00投入动情期雌鼠，至次日上午8:00取出，下午8:00再投入另一批动情期雌鼠，至次日上午8:00取出，如此反复，让其房劳伤肾；每日上午8:00―下午8:00，将雄鼠放人特制的小铁丝笼内，再将此小笼固定在装有一只大家猫的大笼中。让猫与小鼠仅一网之隔，使猫爪能碰到但无法抓到小鼠，并每天上午10:00、下午3:00各另取两只活的小鼠喂猫示众，使其惊恐伤肾。连续21天，制造肾精亏虚模型。3组实验小鼠均自由饮食。 1．4　给药剂量与方法 补肝组每天给予0.3mL/10g体重的一贯煎浓缩液灌胃。正常对照组及模型组予等量生理盐水灌胃。自造模第1天起开始给药，均每天1次，共21天。 1．5　取材方法 将小鼠眼球摘除后沿赤道部切开，去除角膜、晶状体和玻璃体，生理盐水冲洗，用眼科镊缓慢剥离视网膜，采用免疫组织化学ABC法检测视网膜Bcl-2、Bax基因表达。 2　检测方法及结果 2．1　试剂 抗Bcl-2、Bax抗体(Santa Cruz，USA，多克隆抗体，浓度1:150和1:200)；生物素标记的羊抗兔血清；卵白素-生物素；正常小牛血清以上试剂均由美国YHED公司提供，中山公司分装。 2．2　检测方法 切片脱蜡至水后以微波处理10min(95℃)，3％H2O2-70％甲醇室温处理30min，3％正常小牛血清室温孵30min。加入抗Bcl-2、Bax抗体即一抗，温盒内4℃孵育20h，生物素标记的羊抗兔血清即二抗，37℃孵育1h。卵白素-生物素即ABc复合物于37℃孵育11h，DAB。显色，显微镜下监视反应，约10min，以蒸馏水停止反应。苏术素复染或不复染细胞核；梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。阴性对照以正常小牛血清替一抗，其余步骤同上。 2．3　计算机图像分析及统计处理 应用HPIAS 2000型图像分析系统测定阳性率。具体方法如下：取各组小鼠视网膜切片，每只小鼠视网膜切片随机选取6张，每张切片随机取5个视野，进行测定。所测数